3种配方处理吉贝插穗生根过氧化物酶（POD）活性变化的研究

高 柱，伍建榕，严 毅，郑 元，马焕成*

（1.西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，昆明 650224；2.江西省科学院生物资源研究所，南昌 330029）

山地棉是指在山地上种植具有较好适应性，以生产纺织纤维原料为主，具有较高经济效益的新型天然纤维原料类植物的总称，包括木棉科（Bombacaceae）部分植物、牛角瓜（Calotropis gigantean L.）、长生棉（Gossypium peruriaxum）等。山地棉植物的纤维具有中空度高、纺纱强度高、抗菌、光洁等优良特性。棉花是重要的战略储备物资，我国近20年来种植面积下降0.1%，山地棉种植开发能够有效缓解棉粮争地矛盾。木棉纤维中空度高达86%以上，是人工纤维的2倍，具有光洁、抗菌、轻柔、保暖等优点，吉贝[Ceiba pentandra（Linn.）Gaertn.]是山地棉木棉科植物中纤维开发价值较高的树种之一[1-2]。

扦插育苗具有繁殖系数高、可工厂化育苗等优点，是众多树种无性繁殖育苗的首选[3]。林秀香采用沙壤土∶谷壳灰=4∶1基质扦插1年生吉贝半木质化枝条，以初夏梅雨季节成活率最高[4]；本实验前期研究发现，以纯净河沙扦插吉贝，生根率依次为配方1#＞配方3#＞配方2#（1～3#配方主要成分依次为生根粉、吲哚乙酸和萘乙酸），且均达到70%以上，但有关吉贝扦插过程中生理生化指标变化规律的研究尚未见报道。过氧化物酶（Peroxidase，POD）普遍存在于植物体内，参与多种生理生化过程，与植物不定根的发生和生长有密切关系，在植物细胞生长、分化调节及发育进程中起着重要作用[5-6]，Garspar等认为POD活性可作为插穗生根的标志之一[7]。本试验比较了不同专用配方处理对吉贝插穗生根过程中POD活性变化响应规律，为揭示吉贝扦插生根机理提供科学依据。

1 试验地概况

试验在西南林业大学林学院教学试验温室大棚进行。该地位于云南省昆明市盘龙区，地处102°45′16.7″E，25°03′53.9″N，海拔1 959 m。年均温度15℃，积温4 522.6℃，最热月平均气温19℃，最冷月平均气温8℃；昼夜温差大，春、冬两季温差可达12～20℃，紫外线强，光照充足，年均日照时数2 054 h。干、湿季节分明，5～10月为雨季，降雨量占全年85%。试验棚内最低温18℃，最高温48℃，平均气温28℃，最高相对湿度为85%，最低相对湿度为45%，平均相对湿度为80%。

2 材料与方法

2.1 插穗选取及制备

试验于2010年3月7日进行，选取采穗圃地2年生母树的当年生枝条制穗。将剪取的枝条去除叶片，上切口离芽1.0 cm平切、下切口离节0.5 cm处斜切，插穗长20 cm。用石蜡涂抹上切口，剪好的插穗每20根为一捆，用800倍多菌灵溶液浸泡20 min，晾干后备用。

2.2 插床建立及实验设计

采用配有全光照自动间歇喷雾装置的温室育苗池育苗，插床长6 m，宽1.0 m，深40 cm，双面砌墙水泥面，床底铺1层10 cm厚的大鹅卵石，上层铺30 cm纯净河沙。用50%多菌灵可湿性粉剂1 000倍液消毒后，用薄膜覆盖，1周后扦插。分别采用专用配方1#、2#、3#处理插穗1 h。完全随机区组设计，每个处理80根插穗，3次重复，清水处理为对照。扦插深度为穗长2/3，密度50根·m-2。保持河沙湿润，每周消毒1次（800倍多菌灵和甲基托布津交替使用）。及时清除枯穗，新叶完全展开后每隔15 d喷1次2‰尿素。扦插后第0、7、14、21、28、35天取样，每区随机抽取5根插穗，洗净后，观察插穗形态变化，并迅速剥取插穗基部2 cm内韧皮部，超低温冰箱保存，备用。

2.3 POD活性测定方法

称取样品0.1 g，加少许石英砂和液氮研磨，研细后加入2 mL磷酸缓冲液研磨成匀浆，转入离心管，再用2 mL磷酸缓冲液分2次冲洗研钵，并入离心管。10 000 r·min-1冷冻离心15 min，上清液即为酶粗提取液。POD活性测定采用愈创木酚染色法，470 nm波长测定OD值，每分钟读数1次，活性以ΔOD·g-1·min-1表示[8]。

2.4 数据分析

试验数据采用SPSS 16.0进行双变量相关性和单因素方差分析，制图采用Excel 2007软件进行。

3 结果与分析

3.1 插穗生根过程外部形态观察

3种配方处理吉贝插穗生根外部形态观测结果表明，扦插第0～7天，下切口皮层、韧皮部、木质部开始松动，并在木质部外围形成一圈间隙，愈伤组织就在插穗切口形成的间隙处沿韧皮部形成，为乳白色半透明状（见图1-A），有些愈伤组织则在髓芯产生（见图1-B）；第7～14天，愈伤组织继续增多，形成白色突起（见图1-B），此时认为已有根原基分化[3]，随着扦插时间的延长，不定根形成；第14天以后，大量乳白色不定根突破愈伤组织，不定根数量逐渐稳定（见图1-C）；不定根继续伸长，乳白色不定根逐渐木质化，形成灰褐色成熟根系（见图1-D）。因此，吉贝插穗生根可分为3个阶段：0～7 d为愈伤组织形成期，7～14 d为不定根形成期，14 d以后为不定根伸长期。

3.2 三种配方处理插穗POD活性变化规律

由图2-A、B、C可知，3种配方处理吉贝插穗生根过程中，0～21 d时POD活性均呈现“升高-下降-升高”趋势，与CK趋势较相似，其中峰值出现在第14天，大小依次为专用配方3#（55.39 ΔOD·g-1·min-1）、配方 1#（52.29 ΔOD·g-1·min-1）、配方 2#（44.992 ΔOD·g-1·min-1）、 CK（23.96 ΔOD·g-1·min-1），此时经历愈伤诱导期和不定根形成期，至不定根生长期，POD活性开始下降。第21～28天，配方1#的POD活性先降后升；配方2#持续降低，而配方3#则保持上升趋势。配方处理吉贝插穗后，能够显著提高生根过程中7～21 d时插穗的POD活性，并促进生根。

图1 吉贝插穗生根过程中的形态变化Fig.1 Morphological changes of Ceiba pentandra cuttings during rooting process

图2 吉贝插穗生根过程中POD活性变化及相关性分析Fig.2 Changes of POD activity and correlation analysis in Ceiba pentandra cuttings during rooting process

将3种配方处理吉贝插穗生根率与生根过程中POD活性进行相关性分析（见图2-D）可知，生根率与不定根形成期（第14天或峰值）的POD活性呈显著正相关（P=0.038），相关系数r=0.962，而与其他时期POD活性差异不显著。说明POD活性越大，对不定根的形成越有利，并最终提高生根率。

3.3 三种配方处理插穗生根期间POD活性变化比较

将图2-A、B、C数据进行方差分析表明，三种配方处理后在不同天数间POD活性变化差异达显著水平（见表1），说明POD活性与吉贝生根密切相关。3种配方处理都极大影响POD活性，但同一天数时不同配方间差异不显著，说明在吉贝插穗生根过程中，3种配方影响POD活性进而促进生根有近似的生理作用。

表1 3种配方对POD活性作用的方差分析Table1 Variance analysis of the effect of three kinds of proprietary formula on POD activity

4 讨论与结论

4.1 配方处理对吉贝扦插生根阶段的划分

按照不定根在插穗上着生部位不同，可将插穗生根分为皮部生根、愈伤组织生根和混合生根3种类型。吉贝插穗生根先形成愈伤后有不定根，因此，属于愈伤组织生根型。李明等认为易生根的桉树生根过程可分为愈伤组织诱导期、不定根形成期、新根伸长期[9]；难生根的四倍体刺槐硬枝扦插生根分为愈伤诱导期、根原基诱导期和不定根表达与生长期[3]；草本芍药不定根形成包括诱导期、表达期和伸长期[10-11]。本试验3种配方处理吉贝插穗扦插生根可分为愈伤组织形成期（0～7 d）、不定根形成期（7～14 d）、不定根伸长期（14 d以后）3个阶段，与前人的研究结果类似。

4.2 吉贝生根与POD酶活性变化的关系

POD是一类含铁卟啉辅基的氧化酶，普遍存在于植物体内，其同工酶在植物体内具有发育阶段特异性和组织特异性，是一种重要的生长调节酶和生根关联酶[12-13]，在植物生长发育过程中有重要作用，对植物器官形态建成有特殊作用[14]。在生根过程中，POD多种同工酶中除具有清除活性氧外，也能行使吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的作用氧化IAA，从而降低插穗体内IAA浓度，促进根原基的诱导[15-16]。宋金耀等研究认为毛白杨嵌合体扦插生根POD活性有2个峰[17]，扈红军等发现榛子插条生根过程POD活性仅1个峰[18]，而难生根树种四倍体刺槐硬枝扦插生根过程中，POD活性持续呈上升趋势[3]，可见POD活性变化的复杂性及关联度的差异性。本研究发现，POD活性在吉贝扦插过程中表现出相似的变化响应，在生根前两个阶段，3种配方处理插穗POD活性均呈现“升高-下降”趋势，活性增加幅度依次为配方3#、配方1#、配方2#，愈伤组织及不定根形成期POD活性上升，能够抑制伤呼吸和降低自由基的损伤，保护细胞膜系统，并抑制插穗变褐腐烂[16]，POD活性增加是插穗逆境反应酶之一。通过相关性分析还发现，POD活性最高时与吉贝生根率呈显著正相关，POD活性大小与吉贝生根关系紧密。进一步方差分析显示，在扦插进程中POD活性差异显著，而不同处理间差异不显著，说明POD活性与吉贝插穗生根密切相关，且配方处理间存在相似的作用，该结果与黄卓烈等研究结论相似[19]。此外，过氧化物酶（POD）为吉贝生根重要关联酶，且在愈伤诱导期和不定根形成期需维持较高活性。

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