笃斯越橘再生体系的建立

2012-09-20代志国迟夜朦梁晓晶

东北农业大学学报 2012年10期

代志国，迟夜朦，梁晓晶

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

笃斯越橘（Vaccinium ulignosum L.）为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium ssp.）植物，落叶小灌木，果实为蓝紫色小浆果，又名蓝莓，果实中含有较多的花色素苷、黄酮等生理活性成分，有缓解视疲劳、防治高血压、抗癌等功效。笃斯越橘由于生于林间腹地，无污染，是绿色纯天然食品，极具开发利用价值。我国笃斯越橘主要分布在大、小兴安岭及长白山等地区，是东北地区宝贵的森林资源和重要的山特产品之一。近几年，随着我国笃斯越橘果实的大量出口和国内越橘系列产品的开发，目前鲜果市场价格逐年上升，果实供不应求。笃斯越橘因其常规繁殖难度很大，开发和利用受到限制。目前利用植物组培技术进行快繁体系研究较少。为更好地开发利用这一极具经济价值的珍贵野生资源，试验研究利用植物组培技术建立高效、遗传稳定的快繁体系，为笃斯越橘快速繁殖、种质资源保护、遗传转化与创新等提供理论依据和技术支持[1-2]。

1 材料与方法

1.1 材料

笃斯越橘来源于黑龙江省伊春地区，是由伊春市农业推广中心经多年选育的笃斯越橘优系，在每年4月份笃斯越橘休眠期，采集一年生枝条带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理

将一年生笃斯越橘枝条在室温条件下，采用室内水培法促使腋芽萌发，然后将萌动的枝条在10℃条件下预处理7 d。将经过室内水培及10℃条件下处理的枝条，剪取1 cm茎段及长势饱满的单芽为外植体，在流水状态下冲洗1 h后，采用两种方法处理：①外植体为带芽的茎段时，采用75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3次，0.1%升汞浸泡10 min，无菌水冲洗6次，并用无菌滤纸吸去表面水分备用；②以单芽为外植体时，采用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，0.1%升汞浸泡8 min，无菌水冲洗6次，并用无菌滤纸吸去表面水分备用。

1.2.2 培养条件

以改良WPM为基本培养基。制备时，将原WPM 培养基中的 K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA以 Ca（NO3）2·4H2O 684 mg·L-1、KNO3190 mg·L-1、C10H13FeN2NaO873.4 mg·L-1和盐酸硫胺素0.1 mg·L-1代替。添加蔗糖20mg·L-1、琼脂6～8g·L-1用1mol的NaOH调节pH 4.8左右；培养基在121℃、131 kPa条件下灭菌15～20 min。在温度为25℃，光照强度为2 500 lx，光周期为16 h黑暗、8 h光照的条件下培养。

1.2.3 不同激素对茎段及单芽生长的影响

试验采用两种激素处理：以改良WPM为基本培养基，ZT设三种浓度，分别为1.0、1.5、2.0 mg·L-1；NAA设三种浓度，分别为0.2、0.3、0.4 mg·L-1。培养4周后，观察芽的生长状况，统计成活率。

1.2.4 不同外植体类型对增殖效果的影响

以茎段和单芽为外植体培养的无菌苗长到2 cm以上时，进行转接，继代增殖。将绿色幼苗的茎剪切成单芽或1 cm长的带芽小段，接种到添加ZT 1.5 mg·L-1的改良WPM培养基上。培养4周后，观察生长状况，统计增殖系数。

1.2.5 适宜生根培养基的筛选

将增殖培养获得的健壮幼苗从茎基部切下，接种到生根培养基上。培养基采用改良1/2WPM为基本培养，IBA设三种浓度，分别为0.05、0.1、0.15 mg·L-1；IAA设三种浓度，分别为0.1、0.3、1.5 mg·L-1。培养4周后，观察生长状况。

2 结果与分析

2.1 不同激素处理对笃斯越橘茎段萌芽及单芽诱导的影响

笃斯越橘茎段的萌芽及单芽增殖率受到培养基中细胞分裂素的调控，在添加ZT及NAA的培养基上，外植体接种7 d左右开始生长，首先在外植体节处萌生绿色嫩芽，基部产生黄绿色愈伤组织块，但是茎段基部形成的愈伤组织最终不会产生幼芽，20 d后为腋芽开始迅速生长，叶片为新绿色，无黄化叶和枯死叶，1个节可萌生1～4个芽，芽体长至1 cm后，在其叶腋萌发新芽形成较多分枝。由表1和表2可知，对于茎段和单芽而言，ZT浓度为1.5 mg·L-1时，萌芽数多，且增殖倍数最高；NAA为0.3 mg·L-1萌芽数最多，随着NAA浓度增加，增殖率也增加，但在生长过程中幼苗易玻璃化，效果并不理想。

表1 不同激素种类及浓度对笃斯越橘茎段萌芽诱导的影响Table1 Influence of different hormones on stem segments induce buds of Vaccinium ulignosum

表2 不同激素种类及浓度对笃斯越橘单芽诱导的影响Table2 Influence of different hormones on single induce buds of Vaccinium ulignosum

2.2 不同外植体类型对笃斯越橘继代增殖效果的影响

以茎段和单芽经初代培养诱导的丛生芽为外植体，进行继代增殖培养，采用的培养基为WPM+1.5 mg·L-1ZT+1.5 mg·L-16-BA+15 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂。由表3可以看出，茎段诱导的丛生芽转接3 d后腋芽开始膨大，1个节萌发1～4个芽，萌芽数与营养生长的外植体相比要少，2周后新芽长达2 cm以上，新芽叶腋再萌芽形成分枝，增殖倍数达到8.6倍。单芽经初代培养诱导的丛生芽接种1周后可伸长生长至1.5 cm，基部产生少量的愈伤组织，2周后可达到5 cm以上，继代增殖率可达9.4倍。因此，经营养生长培养出的茎段和单芽的丛生芽苗都可用于继代增殖。

表3 不同外植体类型对笃斯越橘继代增殖效果的影响Table3 Influence of different types of explants on Vaccinium ulignosum L.proliferation

2.3 生长素组合对笃斯越橘生根的影响

以改良的1/2WPM为基本培养基，分别添加不同浓度的IAA和IBM组合，比较不同浓度的配比对笃斯越橘生根的影响（见表4）。

由表4可以看出，处理6的效果最好，差异显著，根系发达，叶色浓绿，其生根成活率最高，为82.3%；生根效果最差的是处理1，生根成活率为29.7%，它与处理7差异不显著，其特点是IAA的浓度偏低。通过比较发现，IAA浓度为1.5 mg·L-1，IBA浓度为0.1 mg·L-1的组合最好，其最佳培养基为：1/2WPM+1.5 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1IBA。

表4 不同生长素组合对生根的影响Table4 Influence of different hormones combination on rooting

3 讨论

本试验采用的外植体均采用室内水培及10℃预处理，使外植体处于旺盛的生长状态，减少褐变的发生，增大芽体存活率，与Wolfe等研究结果相符合[3]。本试验采用的改良WPM基本培养基与马艳丽以改良WPM为基本培养基培养矮丛越橘相比效果更好[4]。

有效控制污染是植物组培成功的关键技术之一。本试验中从不同外植体类型筛选结果中的污染率来看，两种外植体都有污染现象的发生，其中以单芽的污染率最小，且启动率最高；带芽茎段污染率较高，其原因是越橘茎上生有绒毛，因此携有的病菌及微生物较多，在消毒过程中很难彻底除掉，如果消毒时间过长则发生褐化现象严重。所以为了保证较高的存活率，用升汞灭菌时间不能过长，从而导致污染率提高[5]。选用越橘单芽作外植体可降低污染率并能有效提高启动率。

本试验采用两种方法针对单芽和茎段两种外植体，与董朝莉研究结果比较，75%酒精浸泡茎段延长1 min，75%酒精浸泡单芽延长至30 s；0.1%升汞浸泡单芽缩短至8 min效果好[6-7]。试验中用茎段作外植体接种培养，发现有部分分化形成愈伤组织，但生长很慢，所得苗生长细弱。而以单芽为外植体接种培养，发现在愈伤化的同时，保持有强烈的分生能力，产生丛生芽，可以不经过愈伤组织脱分化阶段和壮苗培养阶段，所获得的丛生苗质量好，茎叶粗壮，从而简化培养程序，因此，用单芽作为外植体较用茎段为外植体繁殖笃斯越橘具有快速、高效特点。