甘蓝型油菜叶片蛋白质双向电泳体系优化

舒佳宾，文 李，官春云

(1国家油料作物改良中心湖南分中心，长沙410128;2长沙理工大学食品与生物工程系，长沙410114;3衢州市农业科学研究所，浙江衢州324000)

油菜是世界上除大豆之外的第二大油料作物，占全世界植物油供应的13%［1］。中国是油菜生产大国，种植面积和产量居世界之首，其产量和品质影响着中国食用油的安全。油菜菌核病常年发病率在10% ～30%［2］，每年 可 以 使油 菜的 产量 减 少15% ～30%，种子含油量也相应降低1% ～5%［3］。有研究表明，蛋白质组学技术的快速和高通量特点可为植物抗病研究提供新的方向［4，5］。

蛋白质双向电泳(Two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2 － DE)技术［6，7］是利用蛋白质等电点和分子量的不同来对蛋白质进行分离。它通过第一向的等电聚焦(Isoelectric focusing，IEF)使蛋白质按照等电点进行初次分离，然后通过第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)使蛋白质再按照分子量的大小进行第2次分离，进而得到蛋白质的二维分离图谱，图谱中的每个点代表样品中一个或多个蛋白质，而且可以同时呈现出蛋白质的等电点、分子量和在样品中相对含量等属性。近年来，该技术已经被成功的运用到拟南芥［8］、水稻［9，10］、小麦［11］、大豆［12］、烟草［13］、番茄［14］等植物的蛋白组学研究，而在油菜蛋白质组学研究中主要涉及油菜叶片［15］、花［16，17］、种子［18］、根系［19］等材料。笔者比较了甘蓝型油菜叶片蛋白质的提取方法，探讨了蛋白质双向电泳技术优化方案，为运用蛋白质组学方法研究甘蓝型油菜抗菌核病提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为抗菌核病甘蓝型油菜近等基因系98c40和湘油15×98c40(由湖南农业大学油料作物研究所培育提供)，盛花期时利用牙签接种，取叶片进行实验。

尿素、SDS、硫脲、Tris－ HCl、Gly、二硫苏糖醇(DTT)、3－［3－(胆酰胺基丙基)二甲氨基］丙磺酸(CHAPS)、溴酚蓝、PVP购自Sigma公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、N，N’－甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、IPG Buffer、碘乙酰胺、两性电解质、矿物油、低熔点琼脂封胶液、30%甘油溶液、考马斯亮蓝G250购自Bio－Rad公司;牛血清白蛋白(BSA)、蛋白质电泳 Loading buffer等购自天根生物;其余生化试剂为国产分析纯。Protein IEF等电聚焦仪、灌胶模具、电泳仪、GS－800扫描仪等均购自Bio－Rad公司;恒温循环水浴锅购自AmerSham，冻干机为EYELA FDU－2100。

1.2 方法

1.2.1 叶片蛋白质的提取

用TCA/丙酮法提取叶片总蛋白，参照Damerval等［20］的方法，但略做改进。即取1 g叶片，放入预冷的研钵中，迅速加入液氮，并加入约10%PVP和适量石英砂充分研磨成粉末，迅速悬浮于约10倍体积－20℃预冷的含10%三氯乙酸(TCA)和0.07%二硫苏糖醇(DTT)的丙酮溶液中，充分混匀后放在－20℃冰箱中静置过夜，期间颠倒混匀数次。4℃12 000 rmp离心30 min，弃上清;在沉淀中加入约10倍体积－20℃预冷的含0.07%二硫苏糖醇(DTT)的丙酮溶液，混匀后放在－20℃冰箱中静置1 h后，4℃12 000 rmp离心30 min，弃上清，重复4～5次该步骤。将最后获得的沉淀放入冻干机中进行真空冷冻干燥，干燥后的粉末－80℃保存备用。在整个提取过程中尽量保持低温，并加入1 mmol/L的PMSF，以防蛋白质水解。

用Tris－Cl法提取叶片总蛋白。取1 g叶片，迅速放入预冷的研钵中，加入液氮、石英砂和PVP充分研磨。迅速将其转移到离心管中，加入冰上预冷的蛋白提取混合液Ⅰ(65 mmol/L Tris－HCl，调pH值至6.8，0.5%SDS，10%甘油，5%β－巯基乙醇)，漩涡震荡1 min，放入4℃冰箱中静置30 min，期间每10 min震荡混匀1次，4℃12 000 rmp离心30 min，取上清转移到新的离心管中;加入10倍体积预冷的蛋白提取混合液Ⅱ(10%TCA，0.07%DTT的丙酮混合液)，混匀后放入－20℃冰箱中静置1 h，4℃12 000 rmp离心30 min，弃上清;再加入预冷的含0.07%DTT的丙酮溶液震荡混匀，放入－20℃冰箱中静置1 h，4℃12 000 rmp离心30 min，弃上清，该步骤重复3～5次。将最后获得的沉淀放入冻干机中进行真空冷冻干燥，－80℃保存备用。

1.2.2 蛋白质的定量

在1 mg蛋白质样品中加入25 μL水化液(8 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，0.001% 溴酚蓝，临用前加入1.3 mmol/LDTT，0.5%IPG Buffer，1 mmol/L PMSF)，在30℃下震荡溶解30 mim，室温下12 000 rmp离心30 min。蛋白质的定量按照Bradford法，以牛血清白蛋白做标准曲线进行蛋白质含量的测定。

1.2.3 蛋白质的双向电泳

(1)第一向等电聚焦(IEF)。采用17 cm Bio－Rad固相预制胶条，并按照Bio－Rad双向电泳操作手册进行。根据1.2.2介绍方法定量测定蛋白质的含量，计算出所要吸取的样品量，本实验的上样量分别采用1 mg和800 μg进行比较，上样体积为300 μL。将样品加入到聚焦槽中，然后把胶条表面的保护膜去掉，胶面朝下，轻轻放入胶槽中，该过程中应避免气泡的产生。覆盖一层矿物油后，放入等电聚焦仪的电极板上，先50 V水化14 h，再按照表1进行等点聚焦。

表1 等电聚焦程序

(2)胶条的平衡。将胶条放入平衡液Ⅰ(6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris － HCl，20%甘油，130 mmol/L DTT)中，置于摇床上轻摇15 min;然后放入平衡液Ⅱ(6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris－HCl，20%甘油，135 mmol/L 碘乙酰胺)，置于摇床上轻摇15 min。

(3)第二向SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。将平衡后的胶条用SDS－PAGE电极缓冲液冲洗一下，并侧置于滤纸上约1 min，然后转移至分离胶上，并在负极端的外侧加上蛋白质分子量标准蛋白，排净气泡后，用低熔点琼脂糖封胶液封闭，待封胶液凝固后开始进行第二向垂直电泳。开启恒温循环泵使其保持在15℃，30 mA/两块胶，恒流电泳30 min后，改用60 mA/两块胶，恒流电泳大约7.5 h，当溴酚蓝距胶底约1 cm处停止电泳。

(4)染色。运用改良的考马斯亮蓝染色法。染色前用12%的TCA溶液固定1 h，取200 mL染色液(12% 考马斯亮蓝 G250，10%(NH4)2SO4，10%H3PO4)加入50 mL甲醇混合后，放到摇床上轻摇12～24 h进行染色，脱色采用0.1 mol/L Tris－H3PO4(pH 6.5)浸泡1 min，再用25%甲醇漂洗至背景为无色。再复染1次(摇床上2～5 h即可)，再脱色。

1.2.4 凝胶扫描和图像分析

待SDS－PAGE凝胶脱色完全后，用Bio－Rad GS－800扫描仪和Quantity One软件进行图像扫描，扫描分辨率为 300 dpi，扫描得到的图像用PDQuest 8.0.1进行图像分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质提取方法比较

本实验分别采用TCA/丙酮法和Tris－Cl法进行叶片蛋白质的提取，用pH为3～10的17 cm预制胶条跑出的双向电泳图如图1所示。从图中虚线框中可以看出，用TCA/丙酮法提取的蛋白(图1－A)与Tris－HCl法(图1－B)相比，表现出更好的聚焦效果，基本没有条纹状蛋白，且背景也相对清晰。从实线框中对比可以看出，用TCA/丙酮法能够分离出更多的蛋白点，蛋白点清晰，且高丰度的蛋白点有所减少。由于油菜叶片中含有大量的盐离子、多糖多酚、色素等植物次生代谢产物，对蛋白质双向电泳产生一定的干扰，重复性差。所以本实验在传统TCA/丙酮蛋白质提取方法的基础之上，在研磨中加入石英砂和PVP，使研磨更充分，并通过PVP去除多糖多酚和色素，使双向电泳的重复性提高。试验中发现，第1次TCA/丙酮沉淀时放在－20℃过夜，期间需要隔1～2 h震荡混匀1次，后面重复沉淀1 h，沉淀5次左右提取的蛋白质纯度较好。因此，用改良后的TCA/丙酮法更适合甘蓝型油菜叶片蛋白的提取。

图1 不同提取方法下甘蓝型油菜叶片蛋白质双向电泳图

2.2 上样量的确定及蛋白酶抑制剂添加

从图2可以看出，蛋白质成块的聚集在一起，是加样量过多的表现，通过实验发现上样量为每17 cm胶条800 μg较适宜。在提取过程中未加入蛋白酶抑制剂PMSF，容易使蛋白质大量降解，呈模糊的涂抹状，不利于双向电泳的进行。

图2 不同上样量及蛋白酶抑制剂双向电泳图

2.3 预制胶条和分离胶浓度的选择

从图3可以看出，pH3～10的胶条不能把蛋白质很好的分离，大部分蛋白质主要集中在pH4～7之间(图3－A)，改用pH4～7的胶条重新进行双向电泳后发现，原来集中在pH3～10中间的蛋白点已经被很好的分离开(图3－B)，说明用pH4～7的胶条比较合适。

第二向SDS－PAGE中，分离胶浓度影响蛋白质的分离效果。从图4－A中虚线框中可以看出，10%的聚丙烯酰胺凝胶不能很好地使不同分子量的蛋白质得到分离，蛋白质呈纵向条状或聚集成一片;而改用12%的聚丙烯酰胺凝胶后，分离效果明显提高。从图4－B和图3－B中可以看出，运用12%的分离胶结合pH 4～7的胶条，能使蛋白质很好的分离，能够分离出2 000多个蛋白点。

图3 不同pH胶条双向电泳图

图4 不同分离胶浓度双向电泳图

2.4 复染对蛋白点呈现的影响

从图5可以看出，图5－A中虚线框部位只隐约看见几个点，经过2～5 h复染脱色后，在图5－B中很多点变得清晰，而且呈现出图5－A中很多原来没有的点，其他部位的点也相应增加或增强。该现象在后续的试验中都得到了很好的验证，都使蛋白质点增多增强，而且背景基本不加深。这可能是在第1次染色中趋于饱和，但通过脱色过程中甲醇、水等物质的作用，胶的性质发生变化，使其更易和染料结合，从而使低丰度的蛋白质更好的呈现。

图5 不同染色次数的蛋白点呈现效果图

3 讨论与结论

甘蓝型油菜叶片中存在大量的酚类、多糖类、醌类、脂类和色素等植物次代谢产物，多糖中存在高电荷密度能够以离子键与蛋白质结合，多酚能与蛋白质能以氢键结合，干扰蛋白质等电聚焦，所以在提取蛋白质时应尽量去除杂质，且减少蛋白质的降解［21］。周蕴薇等［22］在研磨时加入 PVP能有效去除叶片中多糖多酚等物质。不同的蛋白质提取方法能够导致最后蛋白质点的差异［23～26］，Saravanan 等［25］报道在西红柿中使用三种不同的蛋白质提取方法获得2－DE蛋白质点具有很大的区别。这可能由于蛋白质提取过程中糖基化不同而造成的。而对于不同的实验材料因所含糖类、脂类、色素等物质的不同，所选用的最适提取方法也有所不同［27］。本实验结合前人研究，在叶片研磨时加入约10%PVP和适量的石英砂，运用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，比用Tris－HCl法获得的双向电泳图像更清晰，分离更充分，且稳定性好，适合甘蓝型油菜叶片双向电泳蛋白质的提取。

第二向分离胶合适浓度的选择是蛋白质充分分离的基础。分离胶的浓度与凝胶孔径成反比，蛋白质或多肽在胶中的迁移速率与其分子量成反比［28］当分离胶浓度过小时，容易使小分子蛋白质丢失［29］。本研究通过对比10%和12%分离胶浓度对蛋白质的分离效果，确定12%的分离胶浓度能使甘蓝型油菜叶片蛋白质得到很好的分离。

本试验结果表明，采用改进的TCA/丙酮法比Tris－HCl法更适合甘蓝型油菜叶片蛋白质的提取;用pH为4～7的固相胶条和12%的SDS－PAGE凝胶能够使蛋白质得到充分分离;上样量为800 μL时得到的图片比上样量为1 mg时清晰，分离充分，不产生聚集现象;采用胶块2次复染方法，可加强蛋白质点的染色效果，使低丰度蛋白得以呈现，给后续分析带来便利的同时，增加了差异蛋白点的数目，提高了实验的解析度。总之，通过本实验的研究，建立和优化了适合甘蓝型油菜叶片双向电泳体系，提出胶块复染的作用效果，能够分离出2 000个以上的蛋白点，且实验稳定重复性强，可为后续油菜抗菌核病的蛋白质组学研究提供参考。

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