氧化应激与总肺缺血再灌注细胞凋亡的相关性及川芎嗪干扰的影响

王晓杨 毛宇飞 王万铁 郝茂林 张 波

(金华职业技术学院医学院病理生理教研室，浙江 金华 321000)

组织缺血再灌注(IR)时可观察到细胞凋亡的发生〔1，2〕，并认为细胞凋亡可能是心脏IR损伤发生的重要机制之一〔3〕。川芎嗪(TMP)对大鼠IR视网膜氧化应激水平及细胞凋亡有重要的影响〔4〕。本课题探讨肺IR损伤中氧化应激与细胞凋亡的关系，并探讨川芎嗪对其的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 细胞凋亡试剂:原位末端标记试剂盒 (3%H2O2、Labelling缓冲液)、Tris盐酸缓冲液(TBS)、封闭液生物素化抗地高辛抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色剂等(武汉博士德公司提供)。川芎嗪注射液(批号03041711:山东长富洁净药业有限公司提供)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒由南京建成生物工程公司提供。

1.1.2 动物 由温州医学院实验动物中心提供健康清洁级日本大耳白兔60只，体重2.5～3.0 kg，雌、雄不拘。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及方法 随机分为三组，每组30只:(1)假手术组。(2)IR组，再分三个亚组，每个亚组10只，开胸后左肺门阻断1 h，分别开放接受1、3、5 h的再灌注，于缺血前60 min静脉滴注与川芎嗪等量的生理盐水。(3)川芎嗪干预组(TMP组)，于缺血前60 min静脉滴注川芎嗪60 mg/kg，其余操作同IR组。

1.2.2 模型制备 经兔耳缘静脉注射20%乌拉坦5 mg/kg，麻醉后仰卧位固定于手术台。颈部正中切口，分离左颈外静脉并插管，生理盐水0.5～1.5 ml/min静滴维持;左颈总动脉插管，接肝素化三通管;气管切开插管，接动物呼吸机辅助呼吸，吸氧浓度100%，呼吸频率30～40次/min，潮气量双侧肺通气15～20 ml/kg，单侧8～10 ml/kg。沿胸骨左缘切断第3、4、5肋骨开胸，离断左侧肺下韧带，游离左肺门穿过阻断带备用，颈外静脉注射肝素1 mg/kg抗凝。按Sekido等〔5〕报道的方法复制在体兔IR模型，即在呼气末于左肺门处用阻断带结扎左侧肺动脉、肺静脉及左主支气管，终止左肺血供为左肺缺血持续1 h;开放恢复供血和通气为左肺再灌注。

1.2.3 血液指标测定 缺血1 h或术后1 h，再灌注1、3、5 h，从颈总动脉取血。3 500 r/min低温离心15 min，取血清检测下列指标:①血浆MDA含量:采用硫代巴比妥酸法，采用721分光光度计，在532 nm处比色测定。②血浆SOD活力:采用黄嘌呤氧化酶法，用721分光光度计在550 nm处比色测定。

1.2.4 标本的采集及处理 分别于再灌注1、3、5 h各时限点留取左肺标本，部分标本置于10%甲醛中固定，常规组织学处理、石蜡包埋切片;部分标本置液氮中，后放在-70℃冰箱中冻存待测。

1.2.5 观察指标 肺细胞凋亡的检测采用原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)，按TUNEL检测试剂盒的使用说明书进行。

1.2.6 判定标准 在光学显微镜下观察TUNEL阳性细胞，细胞核染色呈棕黄色为阳性细胞，即为发生凋亡的细胞。

1.2.7 肺组织细胞凋亡分析 于各组切片中任意抽取其中一张切片，采用目测半定量法分析结果，凋亡指数计算方法〔6〕:在高倍视野(×400)下，选择5个视野，分别计数凋亡细胞和总细胞数。计算细胞凋亡阳性个数，用细胞凋亡指数(AI)表示。AI=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%

1.3 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件进行分析，所有实验数据均以±s表示，两组之间比较用t检验，单因素方差分析用于多组均数显著性检验。

2 结果

2.1 各组总血浆SOD活力比较 IR组的SOD活力在再灌注1、3、5 h与假手术组比较显著降低(均P＜0.05)，TMP组在缺血1 h再灌注1、3、5 h SOD活力与IR组比较明显升高(均P＜0.01)，且TMP组在再灌注1、3、5 h与假手术组比较SOD活力明显升高(均P＜0.01)。见表1。

2.2 各组兔血浆MDA含量比较 在缺血1 h再灌注1、3、5 h，IR组与假手术组比较MDA含量显著增高(P＜0.01);TMP组在缺血后再灌注1、3、5 h的MDA含量显著高于假手术组(P＜0.05，P＜0.01)，但却显著低于 IR 组(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

2.3 肺组织细胞AI IR组及TMP组缺血后再灌注1、3、5 h均可见肺组织细胞凋亡现象，但TMP组再灌注同时相点的肺组织细胞凋亡数显著减少(P＜0.01);两组中3 h组凋亡细胞数均明显高于1 h与5 h组(P＜0.01)。采用Pearson法进行相关性分析发现，AI与 MDA含量呈正相关(r=0.764，P＜0.05)，与SOD活力呈负相关(r=-0.665，P＜0.05)。见表3，图1。

表1 兔血浆SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

表1 兔血浆SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与IR组比较:3)P＜0.01

组别1 h 3 h 5 h假手术组109.19±11.04 108.17±10.34 108.28±10.16 IR组 97.74.11±6.671) 99.30±11.281) 97.16±9.581)TMP组 112.15±7.92)3) 125.00±0.432)3) 120.13±7.992)3)

表2 兔血浆MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

表2 兔血浆MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与IR组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别1 h 3 h 5 h假手术组1.61±0.34 1.76±0.38 1.72±0.23 IR组 4.20±0.641) 4.28±0.471) 4.28±0.831)TMP组 2.11±0.761)3) 2.24±0.721)2) 2.42±0.921)2)

表3 各组肺组织细胞AI指数比较(±s，n=10)

表3 各组肺组织细胞AI指数比较(±s，n=10)

与IR组比较:1)P＜0.01;与再灌注1 h和5 h组比较:2)P＜0.01

组别1 h 3 h 5 h假手术组0.60±0.74 0.61±0.64 0.62±0.72 IR组 14.9±1.911) 32.43 ±5.831)2) 18.72±2.251)TMP组 7.9±2.231)2) 22.40±3.021)2) 11.32±2.321)2)

图1 各组光镜下肺组织细胞凋亡情况(×400)

3 讨论

细胞凋亡是在基因控制下的自主有序的细胞死亡，在维持细胞群体数量稳定及功能方面具有重要的作用，组织器官大量的细胞凋亡能够引起该器官的功能明显降低。本研究表明肺IR过程可引起肺细胞凋亡率显著升高，与Fischer等〔7，8〕等研究结果一致。肺IR细胞凋亡与氧化应激具有一定的相关性。本实验表明川芎嗪具有拮抗肺IR过程中细胞凋亡的作用，并且川芎嗪具有减轻肺IR损伤产生的氧自由基介导的脂质过氧化反应的作用。由自由基引发的脂质过氧化反应，导致生物膜上多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应而引起生物膜结构的破坏。MDA是脂质过氧化反应的终产物，是反映脂质过氧化反应的指标，同时也是自由基损伤的指标〔9〕。自由基还可以直接导致蛋白质、核酸、多糖的结构和功能受损〔10〕，这可能是肺IR过程中导致细胞凋亡的主要机制之一。SOD为内源性的氧自由基清除机剂之一，催化超氧阴离子(O-2)转化为H2O。氧化应激产物MDA与AI呈正相关，SOD可拮抗自由基的形成，抑制氧化应激反应，从而抑制减缓细胞凋亡的发生，故与AI呈负相关。该实验表明川芎嗪可抑制氧化应激反应所致的自由基大量形成，从而减轻肺组织细胞凋亡，减轻由氧化应激导致细胞凋亡而引起的肺IR损伤。

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3 姚 震，焦解歌，冯建章，等 心肌缺血-再灌注损伤与细胞凋亡的关系实验研究〔J〕.海南医学院学报，2000;6(3):129-33.

4 施月欢，邹秀兰.川芎嗪对大鼠缺血再灌注视网膜SOD，MD和NO水平及细胞凋亡的影响〔J〕.中国实用眼科杂志，2002;20(1):25-7.

5 Sekido N，Mukaida N，Harada A，et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against in interleukin-8〔J〕.Nature，1993;365(6447):654-7.

6 段 红，李 源，王鲜平，等.川芎嗪对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响〔J〕.武警医学，2000;11(2):70-3.

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9 王万铁.川芎嗪对实验性肠缺血再灌注损伤中氧自由基的抑制作用〔J〕.中华中西医杂志，2001;31(3);197-9.

10 林建东，廖秀玉，刘 宁，等.山莨菪碱防治急性肺损伤及机理的探讨〔J〕.中国医师杂志，2000;2(11):653-5.