老年膀胱造瘘患者生物被膜菌与泌尿系感染的相关性

李乃静 白 雪 潘作东 何 平 (中国医科大学附属盛京医院老年病科，辽宁 沈阳 110004)

随着高分子材料在临床的广泛应用，其相关感染日益引起人们的广泛关注。膀胱造瘘管是解决老年患者尿路梗阻及排尿困难的有效方法，但细菌易于黏附于导管的表面形成生物被膜，导致难治性泌尿系感染。为深入了解生物被膜菌与老年生物材料相关泌尿系感染的关系，我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 对象 本组均为老年男性;年龄72～102岁，平均86岁。耻骨上膀胱造瘘术置管的患者61例，膀胱造瘘导管的材料均为硅胶导管。留置导管时间平均20个月。换管时间4～7 w，集尿袋更换时间3～5 d。置管原因:前列腺良性增生29例，前列腺或泌尿系肿瘤20例，脑血管病变后遗症12例。

1.2 实验仪器 24孔板(天津有机玻璃制品厂)、扫描电镜(S-800日本HITACHI公司)、超声清洗器(GX-250，北京医疗设备二厂)、低温超速离心机(上海安亭公司)、LKB2117等电聚焦系统(LKB公司)、超净工作台 (上海医用设备一厂)、鉴定仪(Bio-Merieux公司、法国)、S800扫描电镜 (Hitachi公司，日本)。

1.3 细菌鉴定 用75%的乙醇纱布擦拭尿管外壁，用无菌剪截取尖端5 cm标本，分为3份，分别用于细菌鉴定、扫描电镜观察、超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的检测。首先将导管超声震荡15 min，使尿管表面生物被膜完全脱落于培养液中，摇匀后吸取10 μl，用生理盐水以10倍梯度连续稀释数倍后，各取10 μl置于胰酶大豆肉汤中培养48 h，然后进行细菌鉴定。

1.4 扫描电镜观察 用无菌生理盐水反复漂洗导管5次，洗去浮游菌及其他黏附物。用PBS缓冲液缓慢漂洗3次，用2.5%戊二醛PBS溶液中4℃固定2 h，以pH7.2的磷酸缓冲液冲洗3次，再以1%锇酸固定2 h，4℃双蒸水冲洗3次，每次10 min，系列酒精梯度脱水，醋酸异戊酯置换，干燥后喷金，扫描电镜观察生物被膜菌形态。

1.5 ESBLs的检测 将脱落于培养液中的菌体离心30 min，弃去上清液，以0.05 mol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤两次后，将收获的菌体悬浮在同样适量的缓冲液中，用冻融法〔1〕使细菌菌体破坏，然后以低温超速20 000 r/min离心60 min，上清液即为粗酶提取液。ESBLs的检测采用标准纸片扩散法〔2〕，测试头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸的抑菌环直径，用CLSI M100-S19标准进行判断，当2组药物中有任何一组在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸抑菌环直径相比，增大值大于或等于5 mm时，确认产ESBLs。

1.6 统计学方法 计数资料组间比较行χ2检验。

2 结果

2.1 扫描电镜观察结果 61例膀胱造瘘患者中，17例平均插管时间(7.4±0.9)d，未见到膜状物;44例平均插管时间(24.4±1.6)d，扫描电镜观察到导管表面覆盖大量的纤维膜状物，膜状物中可见网状裂纹，在裂纹中附着大量细菌，细菌聚集生长(图1)。

图1 细菌生物被膜(×8 000)

2.2 微生物学结果 61例膀胱造瘘患者中细菌培养阳性57例，占87%;培养阴性4例。其培养的阳性频次依次为大肠埃希菌21株(34.4%)、铜绿假单胞菌14株(23.0%)、粪肠球菌11株(18.0%)、阴沟肠杆菌10株(16.4%)、表皮葡萄球菌4株(6.6%)、肺炎克雷白杆菌及产吲哚黄杆菌各2株(3.3%)、真菌6株(9.8%)。

2.3 ESBLs的检测结果 ESBLs阳性菌株共31株(50.8%)，分别为大肠杆菌9株，铜绿假单胞菌6株，阴沟肠杆菌4株，肺炎克雷白杆菌2株。生物被膜菌中产酶阳性菌株39株，占生物被膜菌的86.6%;非生物被膜菌中产酶阳性菌株8株，占非生物被膜菌的47.1%。两组检出率差异显著(P＜0.05)。

3 讨论

泌尿系感染是医院感染中最常见的感染之一，而院内泌尿系感染约50% ～80%系留置尿管或膀胱造瘘所引起〔3〕。特别是老年患者，免疫功能相对较弱，而且往往伴发严重的基础疾病。泌尿系感染的发病率随年龄的增长而增加，且细菌耐药性严重〔4〕，对生命健康构成较大威胁。

留置膀胱造瘘管引起尿路感染的原因很多，首先可造成膀胱损伤，破坏膀胱自然防御的屏障，使细菌更易黏附，且扩大了膀胱与外界的开放程度，增加了感染的机会。膀胱造瘘管引起尿路感染的另一个重要原因在于留置的尿管本身，目前临床使用的尿管多为橡胶或硅胶材料。有研究发现，尿管植入24～48 h后，尿管内可出现纤维蛋白膜状沉积，成为细菌迁徙黏附的支架，细菌黏附后在导管内表面定植并形成菌落，分泌多糖蛋白复合物即生物被膜〔5〕。本研究表明，留置造瘘管的时间越长，形成生物被膜的概率越高。常见的细菌包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌等。细菌间通过数量感知系统，感知到细菌数量的变化，并进行信息传导，最终形成生物被膜〔6〕。

细菌形成生物被膜后，其耐药性大大增强。首先，组成生物被膜的多糖蛋白复合物能阻碍抗生素或其他杀菌剂的渗透，吸附并灭活部分抗生素水解酶，使进入生物被膜内部的抗生素有效剂量大大降低〔7〕;同时，生物被膜菌由于其特殊的结构特点和生理特性，使其生长缓慢、代谢减低、对外界刺激不敏感，对抗菌药物的通透性减弱，尤其是被膜深层的细菌很难被抗菌药物杀灭。低于致死剂量的抗菌药物反而有利于细菌开启抗菌药物水解酶如β-内酰胺酶的表达〔8〕。本研究表明生物被膜菌ESBLs的检出率明显高于非生物被膜菌。且有研究表明，生物被膜菌较普通浮游细菌产生的ESBLs更具多样性和复杂性，即同一菌株可携带多种不同的质粒，同一患者可分离到多种不同基因型的ESBLs产生菌〔9〕。这使其耐药性明显增加。

本研究表明，生物被膜和ESBLs的产生是导致老年膀胱造瘘患者难治性尿路感染的一个主要原因。深入研究生物被膜的形成机制，开发新型生物材料导管，将有利于解决临床上老年导管相关性难治性尿路感染困扰。

1 李乃静，李 伟，李胜岐.老年机械通气患者气管内导管生物被膜的观察〔J〕.中华老年医学杂志，2006;25(2):126-7.

2 李 静.超广谱β-内酰胺酶的特点及其检测进展〔J〕.中国医学检验杂志，2008;9(2):117-20.

3 Trautner BW，Hull RA，Darouiche RO.Prevention of catheter associated urinary tract infection〔J〕.Curr Opinion Infectious Dis，2005;18(1):37-41.

4 Curtin JJ，Donlan RM.Using bacteriophages to reduce formation of catheter-associated biofilms by Staphylococcus epidermidis〔J〕.Antimicrob A-gents Chemother，2006;50(4):1268-75.

5 Cotar Al，Chifiriuc MC，Dinu S，et al.Quantitative real-time PCR study of the influence of probiotic culture soluble fraction on the expression of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing genes〔J〕.Roum Arch Microbiol Immunol，2010;69(4):213-23.

6 Tamashiro E，Antunes MB，Gopikrishna G，et al.Implications of bacterial biofilms in chronic rhinosinusitis〔J〕.Braz J Infect Dis，2009;13(3):232-5.

7 Kuchma SL，Otoole GA.Surface-induced and biofilm-induced changes in gene expression〔J〕.Curr Opin Biotechnol，2000;11(5):429-33.

8 Xu KD，McFeters GA，Stewart PS，et al.Biofilm resistance to antimicrobial agents〔J〕.Micobiology Mar，2000;146(Pt 3):547-9.

9 谷 秀，谭明旗，李胜岐.铜绿假单胞菌生物被膜中AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的检测〔J〕.中国现代医学杂志，2004;14(14):69-72.