TRAIL与环磷酰胺诱导LN215细胞凋亡的作用

张艳春 齐 玲 严 海 金 宏 赵东海 于洪泉

(北华大学第二附属医院麻醉科，吉林 吉林 132013)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)作为一种新型的抗肿瘤药物，在美国已进入临床Ⅱ期实验阶段〔1〕。前期的研究发现，在某些恶性胶质瘤的死亡信号诱导复合体(DISC)成分中，半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、死亡受体5(DR5)具有十分重要的作用〔2～4〕。因此，继续研究其他恶性胶质瘤细胞对TRAIL的敏感性及耐药的机制，可为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供更充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM/F12培养基、小牛血清、0.25%胰酶(美国Gibco公司);rhTRAIL(Peprotech公司);对硝基苯(上海生物工程技术公司);环磷酰胺(CPA，阿拉丁公司，中国)。

1.2 细胞培养 将配制好的DMEM/F12培养基置于培养箱中预热，自液氮罐中取出人恶性胶质瘤细胞系LN215，迅速置于37℃水浴至融化，离心后小心吸出上清，将细胞用1 ml培养基混匀放入培养皿中，再加入9 ml新鲜培养基，轻轻混匀后放入5%CO2、37℃培养箱中，在饱和湿度下培养。待80% ～90%融合时进行传代。

1.3 酸性磷酸酶法检测TRAIL对恶性胶质瘤细胞的诱导凋亡作用 待细胞融合至80%左右，胰酶消化后台盼蓝计数活细胞，以8×103个/孔密度接种于96孔板中，培养24 h，加入不同浓度 TRAIL(0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100，300 ng/ml)，对照组使用基础培养基。24 h后小心弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗去培养基，每孔加入酸性磷酸酶底物检测液(对硝基苯新鲜配制)100 μl，继续培养90 min，加入终止液，室温下孵育5 min。酶标仪405 nm处测定各孔光吸收值。

1.4 酸性磷酸酶法检测TRAIL与CPA对恶性胶质瘤细胞诱导凋亡作用 将细胞以8×103个/孔接种于96孔板培养24 h后，将细胞分为四组，分别为TRAIL组(TRAIL 100 ng/ml)，CPA 组(CPA 10 μg/ml)，联合用药组(TRAIL 100 ng/ml+CPA 10 μg/ml)，对照组(基础培养基)。余步骤同1.3。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，实验数据以±s表示，组间比较用t检验，P＜0.01为差异有显著性。

2 结果

2.1 LN215细胞的培养 恶性胶质瘤细胞株LN215复苏后培养，细胞在复苏2 h开始贴壁，初期呈现圆球形，随着时间的延长，细胞逐渐出现突起，开始呈现长梭形，24 h后90%以上的细胞都已贴壁，大部分可见明显的突起。

2.2 LN215细胞对TRAIL的敏感性 图1可见。经不同浓度TRAIL作用后，细胞最初在TRAIL低浓度时无明显的凋亡发生，甚至出现轻微的增殖现象;但当TRAIL浓度达到1 ng/ml时，细胞开始出现凋亡，并随TRAIL浓度升高，凋亡水平逐渐升高，在300 ng/ml时，凋亡率可达到12%。从 TRAIL作用于LN215细胞的结果来讲，LN215是对TRAIL抵抗的细胞株。

图1 TRAIL诱导LN215细胞发生凋亡情况

2.3 TRAIL联合CPA诱导LN215细胞凋亡作用 LN215细胞经TRAIL作用后，测定结果为0.29±0.02，CPA作用后检测结果为0.23±0.01，TRAIL与CPA联合作用检测结果为0.11±0.01，与对照组(0.29±0.02)相比具有显著性差异(P＜0.01)。

3 讨论

自2007年以来，癌症已成为危胁人类生命健康的最大杀手。癌症的最佳治疗目标是触发肿瘤发生自发选择性细胞死亡，而不引起其他组织的损伤。然而，在癌细胞不断追求生存、阻碍细胞死亡的进程中，往往会发生肿瘤细胞耐药，这就是癌症对放疗和化疗发生抵抗的原因〔5〕。TRAIL可选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，对正常的组织细胞没有明显的毒性作用〔1〕。

研究表明，大部分恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡发生耐药〔6〕。本研究也发现，因此，LN215是TRAIL耐药细胞株。进一步研究TRAIL与化疗药物CPA是否发生协同作用，联合用药组细胞发生明显的凋亡反应，而单独用药组则不出现这种反应，这一结果有力地证实了TRAIL与化疗药物可发生协同作用。但TRAIL与化疗药物发生协同作用的机制还需要进一步研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 Qi L，Bellail AC，Rossi MR，et al.Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis，2011;16(11):1150-64.

3 齐 玲，于洪泉，金 宏，等.Caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗TRAIL诱导凋亡中的作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011;37(4):612-6.

4 南栗岩，齐 玲，肖振晶，等.原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(18):3591-2.

5 Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med，2005;352(10):987-96.

6 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.