芥子碱硫氰酸盐清除超氧阴离子自由基作用的研究

李默影，齐 洁，吴秋月，刘丽芳

(中国药科大学天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏南京210009)

芥子碱硫氰酸盐清除超氧阴离子自由基作用的研究

李默影，齐 洁，吴秋月，刘丽芳*

(中国药科大学天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏南京210009)

目的：研究芥子碱硫氰酸盐清除超氧阴离子自由基的作用。方法：用化学发光法测定芥子碱硫氰酸盐清除超氧阴离子自由基的能力，并以抗坏血酸的清除能力做为对照，以IC50值(清除率为50%时的浓度值)作为评价指标。结果：芥子碱硫氰酸盐和抗坏血酸的IC50值分别为0.135 mmol/L和18.74 mmol/L，后者的IC50值约为前者的140倍。结论：芥子碱硫氰酸盐具有良好的抗氧化作用，可以作为天然抗氧化剂进行开发。

芥子碱硫氰酸盐;超氧阴离子自由基;清除率;IC50值

芥子碱硫氰酸盐(Sinapine cyanide sulfonafe)是芥子碱(Sinapine)存在于十字花科植物中的一种常见形式［1］。近年来的研究揭示了芥子碱是一种非常有价值的天然抗氧化剂［2］，在抗衰老药物的研究中具有重要意义。

研究已经证实，体内多余的超氧阴离子自由基(·O2－)严重危害人类的健康。超氧阴离子自由基(·O2－)主要损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及亚微结构，并引起一系列有害的生化反应［3］。对于清除超氧阴离子自由基的测定，文献报道的方法较多，有化学发光法［4］、极谱法［5］、电泳法［6］等。其中化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一，已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用。

本文采用化学发光法，以邻苯三酚－鲁米诺(PA－L)作为自氧化化学发光体系，以抗坏血酸(Vc)作为对照药物，测定芥子碱硫氰酸盐清除超氧阴离子自由基的能力。以期为其在抗衰老药物研究中的应用提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1仪器与试剂

SHG－C生物化学发光测量仪(上海上立检测仪器厂);PHS－25型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

芥子碱硫氰酸盐(自白芥子中提取，经13CNMR、1HNMR、元素分析等鉴定为芥子碱硫氰酸盐，纯度大于98%(HPLC))。鲁米诺(3－氨基邻苯二甲酰肼)，邻苯三酚均购于Sigma公司。

1.2 发光体系的配制

鲁米诺储备液的配制：取鲁米诺(luminol，3－Aminophthalhydrazide，3－氨基邻苯二甲酰肼，C8H7N3O2，M=177.16)17.7mg 溶于 100 mL 0.1 mol/L的 Na2CO3水溶液中，摇匀，即得(浓度：1 mmol/L)。

邻苯三酚溶液的配制：取邻苯三酚(pyrogallol，C6H3(OH)3，M=126.11)126mg和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra － aceticacid，C10H16O8N2，M=292.25)7.74 mg溶于1 mmol/L的盐酸溶液(浓度：0.01 mol/L)，临用时用蒸馏水稀释 10倍(1 mmol/L)。

碳酸缓冲液(pH值10.2)的配制：取0.1 mol/L Na2CO3210 mL于500 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L NaHCO3溶液90 mL后混匀，再加入111.6mg乙二胺四乙酸，调pH为10.2，，即得。

1.3 方法

鲁米诺试验液：取1 mmol/L鲁米诺储备液与碳酸缓冲液(pH10.2)按(1∶2)的比例混合均匀(临用前配制)。

样品液：精密称取芥子碱硫氰酸盐标准品10.35 mg，置1 mL容量瓶中加纯净水溶解至刻度，摇匀，即得(浓度10.35 mg/mL)。

对照液：精密称取抗坏血酸标准品(Vc)10.00 mg，置1 mL容量瓶中加DMSO溶解至刻度，摇匀，即得(浓度10.00 mg/mL)。

取10 μl样品液加20 μL 1 mmol/L邻苯三酚溶液，加970 μL鲁米诺试验液(总体积1 mL)混合置于发光仪中测定，发光强度(chemiluminescence，CL)以峰高计算。

空白实验以空白溶剂代替样品溶液试验。

对照实验以对照液代替样品溶液试验。以下式计算清除率：

清除率=［CL(空白)－ CL(样品)］÷CL(空白)

清除率为50%时样品的浓度即为其 IC50值。IC50值越小说明该样品清除超氧阴离子自由基的能力越强。

2 结果

芥子碱硫氰酸盐抗氧化能力的测定结果见表1。

表1 样品(芥子碱硫氰酸盐)的测定结果

以后4组数据浓度值的自然对数为横坐标，清除率为纵坐标绘制散点图，经线性回归得方程：y=0.186ln(x)+1.4865，R2=0.987 7，由该方程计算出芥子碱硫氰酸盐的IC50=0.004 97×原液浓度=0.05 mg/mL，即 0.135 mmol/L。

以4组数据浓度值的自然对数为横坐标，清除率为纵坐标绘制散点图，经线性回归得方程：y=50.044ln(x)+103.1，R2=0.948 4，由该方程计算出抗坏血酸的IC50=0.329 76×原液浓度=3.297 6mg/mL，即18.74 mmol/L。

3 结论

芥子碱硫氰酸盐清除超氧阴离子自由基的实验结果表明其具有良好的抗氧化作用，能有效清除·O2－。这个作用明显优于对照药物抗坏血酸，后者的IC50约为前者的140倍。芥子碱硫氰酸盐分子量小，易于吸收，为开发新型具有抗氧化功能的化妆品、保健品和药物提供了新的思路。

［1］ 柯木根，吴国欣，林燕妮，等.芥子碱的研究概况［J］.中草药，2007，38(9)，1436－ 附3.

［2］ 李群，顾瑞琦.十字花科植物中的芥子碱对果蝇的抗衰老作用［J］.应用与环境生物学报，1999，5(1)：32.

［3］ 李培峰，方允中.活性氧对蛋白质的损伤作用［J］.生命的化学，1994，14(6)：1 －3.

［4］ 董彩军，谢明勇，聂少平，等.青钱柳提取物体外抗氧化活性研究［J］.食品科学，2007，28(10)：31 －34.

［5］ 李明静，庆伟霞，杨玉霞，等.七种天然黄酮类化合物对超氧阴离子自由基的清除活性［J］.化学研究，2006，17(10)：73 －75.

［6］ 傅崇岗，杨冬芝.电泳中介微分析法测定超氧化物歧化酶［J］.分析化学，2006，34(4)：517 －520.

Study on the Scavenging Effect of Superoxide Free Radicals by Sinapine Cyanide Sulfonafe

Li Moying，Qi Jie，Wu Qiuyue，Liu Lifang
(State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Objective：To study the scavenging effect of superoxide free radicals by sinapine cyanide sulfonafe.Method：Through chemiluminescence method，the scavenging power of sinapine cyanide sulfonafe on superoxide free radicals was determined.The scavenging power was compared to ascorbic acid and the evaluation index is IC50(the concentration when the scavenging rate is 50%).Results：The IC50of sinapine cyanide sulfonafe and ascorbic acid are 0.135mmol/L and 18.74mmol/L，respectively.The latter is about 140 times of the former.Conclusion：Sinapine cyanide sulfonafe has the very good antioxidant effect and can be developed as a natural antioxidant.

sinapine cyanide sulfonafe;superoxide free radicals;scavenging rate;IC50

R285

A

1006－9690(2012)03－0011－02

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.03.003

2011－08－05

李默影(1986－)，女，在读硕士研究生，主要从事中药分析研究。

*通讯作者：刘丽芳(1969－)，女，江西萍乡人，博士，教授，主要从事中药活性成分研究。E－mail：liulifang69@126.com