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广西甜茶苷柱纯化工艺研究

2012-09-18葛益银张凌云

中国野生植物资源 2012年5期
关键词:聚酰胺大孔蒸馏水

葛益银,张凌云

(华南农业大学园艺学院,广东广州510642)

广西甜茶苷柱纯化工艺研究

葛益银,张凌云

(华南农业大学园艺学院,广东广州510642)

以含70%的广西甜茶粗提取物为原料,通过柱纯化与重结晶对甜茶苷进行提纯,从而制备高纯度的甜茶苷单体。以聚酰胺和LSA-10大孔吸附树脂树脂为吸附剂乙醇为洗脱剂进行柱纯化。实验表明,比较聚酰胺与大孔吸附树脂的吸附与脱附能力,皆为后者强;比较不同吸附材料处理所得甜茶苷单体的纯度,则是聚酰胺所吸附的样纯度高,特别是25%乙醇的处理样。

甜茶苷;柱纯化;聚酰胺;大孔吸附树脂;HPLC

众所周知,适量蔗糖可以增加机体ATP的合成,有利于氨基酸的活力与蛋白质的合成。但摄入过多的蔗糖则容易导致肥胖症和龋齿,而且间接导致糖尿病和冠心病等的发生。因此,开发无(低)糖、低能量甜味剂是至关重要的。

罗汉果、甜叶菊和甜茶是广西最为知名的三大甜味植物,其中甜茶的口感是人们最易接受,也是世界上所发现的甜味植物中最为理想的[1]。广西甜茶(Rubus suavussumus S.Lee),落叶灌木,味甜可食。20世纪80年代由植物学家李树刚命名为悬钩子属的一个变种,主要分布在广西的柳州、桂林、梧州等地区[2]。甜茶的主要甜味成分是甜茶苷(Rubusoside),又称甜茶素、甜叶悬钩子苷,为斯替维醇(Steviol)和葡萄糖结合而成的四环二萜甙,分子式为C32H50O13,在化学结构上与甜叶菊苷(Stevioside,斯替维甙)相似[3]。甜茶苷的甜味纯正程度接近蔗糖,但其相对甜度是2%蔗糖溶液的150倍[4]。

目前,国内外对甜茶苷的研究主要集中在提取、测定、药理及应用研究,对纯品的制备研究略有涉及,但工业化的生产投入则几乎没有。过去多采用有机溶剂萃取和离子交换树脂等方法对甜茶苷进行提取,但溶剂萃取法有溶剂残留,离子交换处理的处理量小,二者的提取率比较低[5]。根据陈全斌等对高浓度甜茶苷的制备和周如金等对大孔吸附树脂提取甜茶苷的研究[3,6],本次实验以含70%甜茶苷的甜茶提取物为原料,用聚酰胺粉和大孔树脂对甜茶苷进行吸附,采用蒸馏水和不同梯度的乙醇进行解析,以柱纯化、重结晶等实验方法研究制备高纯度的甜茶苷单体,从而选出一个相对最适方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

淡黄色粉末状甜茶苷样品(纯度70%)、甜茶苷对照样(纯度98.4%),桂林集琦实力天然物有限公司;聚酰胺粉(100-200目),国药集团化学试剂有限公司;LSA-10大孔吸附树脂,西安蓝晓科技有限公司;95%乙醇(食用级);甲醇(分析纯AR,色谱纯LC);超纯水,蒸馏水。

1.2 实验设备与仪器

AB204-N电子分析天平,上海人和科学仪器有限公司;THA-82A台式恒温振荡器,江苏金坛新一佳仪器厂;DK-8D电热恒温水浴锅,上海世义精密仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;AGILENT 1200液相色谱仪,Agilent—安捷伦科技有限公司;依利特色谱柱(填料:Hypersil ODS2 5 μm,尺 寸:4.6mm × 250 mm,柱 号:E1912578,批号:5/120/8619);聚偏氟乙烯微孔滤膜(F型),上海兴亚净化材料厂;针头滤膜(有机系,0.45 μm);一次性使用无菌注射器;其他实验仪器:40 mm×500 mm层析柱。

2 实验方法

2.1 吸附剂预处理

2.1.1 聚酰胺预处理

聚酰胺粉,用90% ~95%乙醇浸泡,不断搅拌,除去气泡后装入柱中,用3~4 BV(BV为层析柱中树脂床的体积)的90% ~95%乙醇洗脱,洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣。再依次用2~2.5 BV的5%NaOH溶液、1 BV的蒸馏水、2~2.5 BV的10%醋酸水溶液洗脱,分别除去醇溶性、碱溶性和酸溶性杂质,最后用蒸馏水洗脱至pH中性,备用。

2.1.2 大孔吸附树脂预处理

大孔吸附树脂,用无水乙醇浸泡24 h,除去气泡后装柱,再用无水乙醇洗脱,洗至洗脱液透明无白色浑浊,然后依次用2 BV的质量分数3%质量分数NaOH溶液,3 BV的3%HCl溶液洗脱,分别除去醇溶性、碱溶性和酸溶性杂质,最后用蒸馏水洗脱至pH中性,备用。

2.2 静态吸附实验

静态吸附实验,参考文献[6],具体步骤如下:准确称取经过预处理的聚酰胺和大孔吸附树脂各1.0 g,放置于三角瓶中,各加入质量浓度为6.0 g/L的甜茶苷样品溶液100 mL,摇匀室温放置24 h(每8 h摇动1次)后过滤,测定滤液中甜茶苷的质量浓度,计算吸附量(Qe)和吸附率(E)。

式中:c0-吸附前溶液质量浓度,g/L;ce-吸附后质量溶液浓度,g/L;v1-溶液体积,mL;Qe-吸附量,mg/g;m-吸附剂干质量;E-吸附率,%。

2.3 静态脱附实验

静态脱附实验,参考文献[6],具体步骤如下:按上述2.2静态吸附实验,制得吸附了甜茶苷并经过滤的聚酰胺4组,大孔吸附树脂4组。分别加入60 mL蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇,置于摇床缓慢振动进行解析(摇床温度设置为25℃),24 h后测解析液质量浓度,计算解析率。

式中:cd-脱吸液质量浓度,g/L;v2-脱吸液体积,mL;Qd-脱附量,mg/g;D-解析率,%。

以上,静态吸附与脱附实验中c0、ce、cd均进行HPLC高效液相色谱分析,通过峰面积换算得出。

2.4 甜茶苷的单体制备

甜茶苷的单体制备,依据静态吸附与脱附实验,参考文献[3,6],具体实验步骤优化如下。取甜茶苷样品3 g,用蒸馏水溶解并定容至10 mL,过层析柱(40 mm×500 mm),收集柱流液,并用脱附剂(蒸馏水,25%,50%,75%的食用乙醇)淋洗至无甜味,流速为3 BV/h,合并液体,旋干回收(旋转蒸发仪50℃),得样品 A。将样品 A,加入 25 mL甲醇(AR),70℃水浴加热至全部溶解,趁热过滤,滤液0℃放置48 h以上,析出白色晶体,过滤,得样品B。用少量甲醇洗涤晶体。重复上述过程,重结晶2次,得样品C。将C放置烘箱,调制65℃,烘4 h,得白色粉末状固体D,称重;复烘,直至两次称量值差不超过0.001 g。

2.5 甜茶苷的HPLC测定

对液相色谱仪进行预处理,先赶气泡,再用甲醇(LC)和超纯水对色谱柱进行梯度洗脱,每一次洗至基线平衡,无峰出现,除去杂质。将样品D溶于超纯水(1 mg/mL),进行HPLC分析,以超纯水做空白试验,采用内标法,去除空白样中溶剂影响而出现杂质峰的时间段,以峰面积(%)换算,得样品D纯度。色谱条件:依利特色谱柱(5 μm,4.6mm ×250 mm);流动相为 V(甲醇):V(水)=65∶35;流速为1.0 mL/min;检测波长为210 nm,带宽4 nm,参比360 nm,带宽1 000 nm;柱温为30℃。HPLC分析完后,继续对色谱柱进行洗柱,先流动相洗30 min,再用甲醇洗30 min,至基线平衡。

2.6 甜茶苷的感官审评

分别称取 50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg纯化过的甜茶苷样品D溶于250 mL沸水中,冷却室温,按溶液浓度高低,审评其滋味;按溶液甜度分别记“+”,并确定其最佳配比。

3 结果与分析

3.1 聚酰胺与大孔吸附树脂的吸附与解析能力比较

由标样可知,质量浓度为6.0 g/L的甜茶苷溶液,在13.442 min时出现所需要的峰,峰面积为2.180e4 mAU·s。

表1 静态吸附结果

表2 静态脱附结果

由表1、2,可以看出,LSA-10大孔吸附树脂的吸附量(101.652 mg/g)与吸附率(24.203%)远远大于聚酰胺粉的吸附量(29.277 mg/g)与吸附率(6.971%)。显然,LSA-10大孔吸附树脂的吸附效果是强于聚酰胺粉的吸附效果的。但对于二者,选用不同梯度的乙醇对甜茶苷进行解析(解析率:A149.595, A250.005, A361.892, A470.909;B118.770,B240.078,B365.163,B482,281),纵向上看,都是乙醇浓度越高,解析效果越好。横向比较,则同一梯度乙醇对LSA-10大孔吸附树脂的解析变化强于聚酰胺粉的,且变化趋势没有聚酰胺粉吸附的稳定。

3.2 吸附材料对甜茶苷得率与纯度的影响

3.2.1 吸附材料对高纯度甜茶苷样品D的影响

表3 高纯度甜茶苷样品D的得率

在实验过程中,LSA-10大孔吸吸附树脂吸附甜茶苷后,用蒸馏水进行解析,但过程中一直无甜味,最终无法收集柱流液,可能是因为此方法处理下,LSA-10大孔吸附树脂的吸附率(24.203)还大于其解析率(18.770),因而没办法将甜茶苷洗脱回收。用25%乙醇进行解析,有甜味,旋转蒸发后,加甲醇,0℃冷藏,但无结晶,没有得出最终产品D。分析原因:①25%乙醇对LSA-10大孔吸附树脂进行解析,其解析率(40.078%)略强于吸附率(24.203%),洗脱液有甜味,但样品不纯,脱附剂进行解析时,可能同样解析出其他物质(鞣类物质,黄酮类物质),导致洗脱液中溶质不纯不会析出结晶体;②脱附剂洗脱时,洗脱出甜茶苷量少,溶于甲醇后,溶液浓度低于能析出结晶体的浓度。

由表3可以看出,提取率(A113.000,A218.800,A322.100,A417.233;B319.400,B424.333)最高的是B4处理。横向比较,聚酰胺粉的纯化效果强于LSA-10大孔吸附树脂的纯化效果,不管是蒸馏水还是梯度乙醇都能解析出样品D。从纵向比较,聚酰胺粉的纯化效果和静态吸附与脱附实验比较不成规律性变化,而LSA-10大孔吸附树脂的纯化只能得出两组结果,但相对符合静态吸附与脱附实验的结果。

3.2.2 不同吸附剂不同洗脱剂对样品D纯度的影响

表4 不同处理所得样品D的HPLC分析结果

除A4D外,其他样品D的纯度均高于标样,证明此实验中研究方法均可行,特别是聚酰胺的效果强于LSA-10大孔树脂的效果。而聚酰胺的处理样,从乙醇浓度梯度来看,25%乙醇效果最好。

3.4 甜茶苷感官审评结果与分析

根据相关文献资料,高纯度的甜茶苷为极甜无苦味的物质。为了验证本研究的纯化效果,采用热水水溶剂法配制不同浓度的甜茶苷溶液。结果表明:

通过对不同浓度的甜茶苷溶液进行感官审评,纯度较高的甜茶苷的质量浓度0.6mg/mL的配比最为适合。这一配比,甜度明显,但又不会太过强烈从而掩盖其他味道。作为一种天然甜味剂,以质量浓度0.6mg/mL加入食品中,既不影响原有味道,又有着幽幽的清甜,因而有着良好的发展前景。

表5 不同浓度甜茶苷感官审评结果

4 结论

通过实验室的一系列研究,可以得出:比较聚酰胺与大孔吸附树脂的吸附与脱附能力,皆为后者强;但比较不同吸附材料处理所得甜茶苷单体的纯度,则是聚酰胺所吸附的样纯度高,特别是25%乙醇的处理样。实验最终到高纯度的甜茶苷单体,证明此方法可获得高纯度的甜茶苷。但如若应用于工业,如考虑将甲醇试剂改用成急性相似的无毒性溶剂。另一方面,从甜茶苷的感官审评看,其作为食品添加剂——甜味剂的效果也是可行的。

通过本次实验,阅读文献,发现对甜茶的研究还是值得深入探讨的。如:①将野生的甜茶进行选种、育种、驯化,有计划的管理和栽培,从而增加产量;②将甜茶的加工工艺中融入传统茶类的加工方式,制成类茶饮料,从而直接市场销售,满足部分消费者的需求。

[1] 张巧云.广西甜茶中甜茶素及其他化学成分的研究[D].桂林:广西师范大学,2006.

[2] 张桂玲,温四民.甜味植物研究进展[J].安徽农业科学,2006,34(18) :4712 -4713.

[3] 陈全斌,张巧云,义祥辉.高纯度甜茶甙的制备[J].林业科技,2006(7)4:55 -56.

[4] 吴金娇,陈全斌.甜茶甙甜味特性的研究[J].试验报告与理论研究,2008,11(9):14 -15.

[5] 何伟平.天然甜味剂——甜茶苷的工艺化实验[J].广西轻工业,1991(1):1 -5.

[6] 周如金,黄敏,张玲,等.大孔吸附树脂提取甜茶苷的研究[J].林产化学与工业,2008,28(5):35 -39.

Study on Extraction of Rubusoside from Rubus suavissimus S.Lee by Column Purification

Ge Yiyin,Zhang Lingyun
(College of Horticulture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

This experiment takes the standardized Extracts of Rubus suavussumus S.Lee that containing 70%Rubusoside as the raw material.Silica gel column chromatography and crystallization are simple and available methods to isolate Rubusoside.We use these methods in order to get some high purity Rubusoside.In column adsorptive purification,we use the polyamide and Styrene LSA -10 as the adsorbing material.And we use the ethanol of different volume concentration to elution.According to the conclusion of these experiments,the adsorptive capacity and the resolving power of Styrene LSA -10 are better than that of polyamide.But,comparing with different adsorption materials deal,the polyamide get the high purity,especially 25%ethanol processing samples.

Rubusoside;column purification;polyamide and Styrene LSA-10;HPLC

S566.9

A

1006-9690(2012)05-0033-04

10.3969/j.issn.1006-9690.2012.05.0009

2012-03-18

葛益银(1987-),女,华南农业大学在读研究生。研究方向:园艺植物的加工与综合利用。E-mail:gyyag@126.com

导师简介:张凌云,男,副教授。E-mail:lingyunzh@163.com

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