基于磁性纳米颗粒微阵列技术的MT-2A基因启动子单核苷酸多态性分析

荣高翔，傅 娟

（湖南工业大学 绿色包装与生物纳米技术应用重点实验室，湖南 株洲 412007）

0 引言

金属硫蛋白（metallothionein，MT）是重金属代谢应答反应中一类重要的小分子蛋白。根据等电点和氨基酸组成的不同，发现MT基因在哺乳动物中至少有MT-1，MT-2，MT-3和MT-4等4种主要形式[1]。其中MT-1和MT-2基因表达范围最广，几乎存在于哺乳动物的所有器官或组织中，尤以肝、肾细胞为主，而且主要被镉特异性诱导[2-3]。在正常水平下，MT-2A基因型的表达量多于MT-1基因，约占所有金属硫蛋白异构体表达量的50%[4]。有报道表明，造成MT-1与MT-2A基因表达量的差异，可能与MT-2A基因启动子区域的增强子活性较强有关[5]。针对美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中人类MT-2A基因已发现的27个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）位点中，核心启动子区域TATA盒附近-5A/G（rs 28366003）SNP位点备受关注。本文拟对湖南省株洲市某冶炼工作业人群外周血中MT-2基因核心启动子区域TATA盒附近-5A/G的SNP位点进行检测，分析该人群中基因型分布特点，以期为深入探讨我国汉族人群MT-2A基因多态性特点提供一定参考，也可为进一步探讨MT-2A基因在重金属毒性易感中的作用奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

以湖南株洲某冶炼厂作业工人共288例为研究对象（均为汉族）；其中，男性176例，平均年龄为（42.52±14.20） ；女性112例，平均年龄为（38.81±12.48），在研究对象知情并同意下，各抽取外周静脉血5 mL，经EDTA抗凝处理后，于-80℃保存，以备基因组DNA提取。

1.2 主要材料与仪器

MT-2A基因扩增上游引物( FP) 5’-GGG CCG CCT TCA GGG AAC TG-3’，生物素修饰的下游引物( bio-RP) 5’bio-GGA CTT GGA GGA GGC GTG GT-3’；检测等位基因特异性的野生型荧光探针(W-probe) Cy3-CGCTGCACTCCAC和突变型荧光探针(T-probe) Cy5-CGCTGCGCTCCAC ；上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司标记并合成；γ-氨基丙基三乙氧硅烷 （γ-Aminopropyltriethoxysilane，APTS）和戊二醛均购于Sigma公司；杂交液和链霉亲合素均购于上海生工生物工程有限公司；粒径约100 nm的SiO2/（ PMMA/Fe3O4） （polymethylmethacrylate，PMMA）磁性纳米颗粒为本实验室自备；所有化学试剂均为国产分析纯；Taq DNA聚合酶、DNA marker、dNTP为Promega产品； 琼脂糖购于上海生工BBI公司； PTC220型PCR扩增仪为MJ Research公司产品； GenePix 4100A荧光扫描仪为美国Axon仪器公司产品；Nano2 Plotter型点样仪为美国Affymetrix产品。

1.3 基因组DNA的提取与鉴定

人外周血基因组DNA提取采用改良碘化钾方法，DNA含量和纯度鉴定采用核酸蛋白定量仪和琼脂糖凝胶电泳法。具体方法是取EDTA-Na2抗凝外周血400L加至1.5 mL离心管中，加灭菌去离子水900L，10 000 r/min离心5 min，弃去上清液；在沉淀中加入5 mol/L KI溶液100 μL，旋涡振荡使其充分溶解，静置2 min；加入质量分数为0.9 %的NaCl溶液300 μL，氯仿/异戊醇(24:1)750L，旋涡震荡，充分混匀，静置2 min；12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液；在上清液中加入400L异丙醇，轻轻混匀，10 000 r/min 离心5 min，弃去上清液；在沉淀中加入1 000L体积分数为70%的冰乙醇，10 000 r/min 离心5 min，弃去乙醇，在真空冷冻干燥仪中干燥；加入80L灭菌去离子水或TE，55℃水浴30 min溶解；鉴定则是取5L DNA工作液用质量分数1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的完整性；最后将提取的基因组DNA置于-20℃冰箱冷冻储存。

1.4 磁性纳米颗粒表面的引物连接

利用APTS与戊二醛在SiO2/( PMMA/Fe3O4)磁性纳米颗粒表面修饰上醛基，然后取修饰醛基的磁性颗粒10 mg加入含体积分数10%亲合素的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）2.5 mL中，于37 ℃下孵育3 h。将 10mol /L生物素标记的50L下游引物加入包被亲合素的磁性纳米颗粒中，室温下孵育1 h，并将该溶液不断振荡混匀。反应结束后，用外加磁场将颗粒从反应介质中分离出来，并用PBS溶液反复清洗产物，最后以4.0 mg/mL的质量浓度分散在 PBS溶液中备用。

1.5 基于磁性纳米颗粒表面的基因特定片段PCR扩增及鉴定

1.6 双色荧光杂交的微阵列SNP分型

[6]的方法进行SNP分型检测，即将固定有ssDNA的磁性纳米颗粒反复清洗后，分别加入10 mmol/L荧光标记探针W-probe和体积分数T-probe各1L与杂交液混匀后于37 ℃杂交1 h，然后经柠檬酸钠溶液（saline sodium citrate，SSC）和体积分数0.1%十二烷基硫酸钠（sodiumdodecyl sulfate，SDS），反复清洗后，将其均匀地分散于15L体积分数3%SSC缓冲液中，于95℃变性5 min，置于冰上骤冷，磁分离后吸取上清液点样于干净的载玻片上，经荧光扫描仪扫描分析，获得样品分型图像，并经分析软件 Genep ix 6.0分析后转化为数据。

1.7 测序验证

根据磁性纳米颗粒微阵列SNP分型结果，各抽取1份MT-2A基因的多态等位基因型（AA型、AG型、GG型）的PCR扩增产物，送上海生工生物工程有限公司直接测序，以验证其分型的准确性。

1.8 数据处理

数据采用统计分析软件包SPSS 16.0处理。应用拟合优度χ2检验MT-2A基因型频数是否符合Hardy-Weinberg ( H-W) 遗传平衡定律。

2 结果

2.1 基因组DNA的鉴定

图1为基因组DNA产物。如图所示，改良KI法提取后的DNA产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测发现，8个样品均具有一条较清晰的泳带，说明基因组DNA产物的提取合格，可以用于进行PCR的扩增。

图1 基因组DNA产物的1%琼脂糖电泳图Fig.1 The 1% agarose pattern of DNA products

2.2 磁性纳米颗粒介导的MT-2A基因PCR扩增

图2为PCR扩增产物的电泳图。如图所示，磁性纳米颗粒介导的MT-2A基因PCR扩增产物经质量分数2%琼脂糖凝胶电泳检测发现，与标准分子量Marker条带相比，各泳道中均在约222 bp大小相对应位置有一条清晰的亮带，说明磁性纳米颗粒表面介导的PCR反应体系中能扩增出所需的目的片段。

图2 PCR扩增产物的2%琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 The 2% agarose gel pattern of PCR products

2.3 基于磁性纳米颗粒微阵列技术的MT-2A基因SNP分型

图3为PCR产物的荧光信号扫描图。如图所示，经荧光扫描仪检测获得双色荧光杂交微阵列芯片中SNP分型信号呈现的绿色、黄色和红色分别代表随机6个样品在MT-2A基因rs28366003位点的3种基因型。其中样品S1，S2，S3的绿色信号代表AA基因型；样品S4，S5的黄色信号代表AG基因型；样品S6的红色信号代表GG基因型。虽然不同的样品具有不同的荧光强度，但该分型结果均具有较高的正错配信号比。

图3 M-2A基因rs28366003位点SNP分型荧光信号扫描图Fig.3 The fluorescence signal scanning of MT-2A gene rs28366003 site SNP genotyping

2.4 直接测序验证

针对基于磁性纳米颗粒微阵列技术的MT-2A基因SNP分型检测结果，选取S1, S4, S6进行直接PCR产物的测序，结果如图4所示。在MT-2A基因rs28366003位点处（方框标注处），样品S1只检测到单一的A峰，显示其为AA基因型；样品S4在该处同时检测到A峰和G峰，显示其为AG基因型；而样品S6只检测到单一的G峰，表明其为GG基因型。其测序结果与基于磁性纳米颗粒微阵列技术的MT-2A基因SNP分型结果完全一致。

图4 样品S1, S4, S6测序图Fig.4 The sequencing graph of sample S1,S4 and S6

2.5 MT-2A基因型和等位基因频率分析

MT-2A基因型和等位基因频率分析如表1所示，288个样品的基因型（AA型, AG型和GG型）频率分别为87.4%, 11.8%和0.8%。其等位基因A和G的频率分别为93.3%和6.7%。经拟合优度χ2检验，该人群MT-2A基因型与等位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（p>0.05）。

表 1MT-2A基因基因型和等位基因频率分布Table1 The distribution of genotype and allele frequencies of MT-2A gene

3 结语

MT基因是机体内重金属应答反应中的一类重要基因，在机体中的表达水平可反映该基因的应答功能。而基因表达主要由核心启动子区域的顺式作用元件和TATA盒决定。金属硫蛋白的核心启动子区域包括金属反应元件（MREs）、糖皮质反应元件（GRE）、抗氧化反应元件（ARE）、环磷酸腺苷反应元件（cAMP）、组织纤维蛋白溶酶原激活剂（TPA）反应元件和干扰素反应元件。在人体MT-2A基因上游区域中，至今发现了7个金属反应元件（MREa to MREg）。在TATA盒附近，金属转录因子（MTF-1）激活金属硫蛋白启动子区域的金属反应元件（MREs）进行转录。当人体暴露于金属或氧化压力下时，金属转录因子便会被激活并实现上述金属反应元件的转录。而MT基因的转录需要MER进行调控。相较于其他普通区域的基因，位于核心启动子区域，特别是在TATA盒附近的基因发生突变将使目的基因的表达产生更大的影响，会降低MTF-1结合MREs的亲和力，并减少金属硫蛋白基因的转录[7]。K. Kita等研究发现人群MT-2A基因启动子区域-5A/G的SNP分型与体内MT-2A基因的转录水平表达减少密切相关[8]。因此，本文研究MT基因核心启动子区域的多态性分布特点具有重要意义。

本研究通过应用基于磁性纳米颗粒微阵列技术对MT-2A基因rs28366003位点进行SNP分型具有高效、简单和廉价的特点。随机选取的288例冶炼作业工人血液样本中，大多数个体具有AA基因型，为251例；AG基因型为34例，GG基因型为3例。经检验，该人群MT-2A基因型与等位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。有研究报道，GG基因型个体比AA基因型个体有较低含量的锌和较高的镉与铅，推测GG基因型个体可能对重金属毒性易感[9]。本研究初步探讨冶炼作业人群中MT-2A基因核心启动子区域SNP分型分布特点，对深入大规模研究我国重金属暴露人群的MT-2A基因功能具有重要意义。关于MT-2A基因的SNP位点与重金属毒性易感是否存在关联有待进一步研究。

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