比格犬一种新雌激素β受体可变剪切体的克隆及鉴定

任秀梅，赵彦斌，孙兆增，许 琴，白杰英，刘 一，胡仲明，靳 朝，曾 林

(1.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062;2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071;3.兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科，乌鲁木齐 830000)

比格犬一种新雌激素β受体可变剪切体的克隆及鉴定

任秀梅1，2，赵彦斌2，孙兆增2，许 琴3，白杰英2，刘 一2，胡仲明2，靳 朝1，曾 林2

(1.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062;2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071;3.兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科，乌鲁木齐 830000)

目的 对比格犬雌激素β受体的新剪切体进行克隆与鉴定。方法 以比格犬垂体组织为模板，用RT-PCR方法从垂体组织中扩增雌激素β受体，电泳确定新剪切体的存在情况.并对其进行克隆和序列测定.结果 利用设计的引物得到2条明显电泳条带，通过测序表明其中一种为新的可变剪切体，目前此可变剪切体尚未见报道。结论 得到了雌激素β受体的一种新的可变剪切体，有助于研究雌激素β受体可变剪切体的功能及其在生殖调控过程中的作用。

比格犬;雌激素受体β;基因克隆;可变剪切体

近几年，对比格犬生殖调控机理和技术的研究已成为国内外的热点研究问题之一，哺乳动物的雌激素调节着生殖系统的发育以及调控发情周期［1］。雌激素通过雌激素受体发挥其生物学作用，在大多数的哺乳动物体内都存在ERα和ERβ两种雌激素受体，并且每种受体都有多种剪切异构体，除野生型ERβ外，人还存在六种、小鼠有两种、大鼠有三种ERβ剪切异构体，不同动物ERβ的剪切异构体千差万别，并且这些不同剪切异构体的功能也不尽相同。目前通过对小鼠、大鼠和人的不同ERβ剪切异构体结构和功能的研究，在动物生殖调控方面取得了长足进步，特别是在生殖系统肿瘤方面［2］。但目前对比格犬的ERβ及其剪切异构体的研究报道却相当匮乏，因此本实验拟通过克隆比格犬雌激素β受体基因，明确比格犬雌激素β受体可变剪接体的存在情况，为进一步明确雌激素β受体在生殖调控过程中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂:

Trizol(Invitrogen);DEPC(Promega);反转录试剂盒 ReverTra Ace(TOYOBO);pMD18-T载体(TaKaRa);标准分子量核酸 DNA Marker2000购自康为世纪公司;凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州BioFlux公司。

1.1.2 菌种:大肠菌株TOP10感受态细胞购自博迈德生物公司。

1.1.3 实验动物:比格犬4只，军事医学科学院实验动物中心提供(实验动物合格证号［SCXK-(军)2002-001］)，实验动物使用合格证号［SYXK-(军)2007-005］。

1.2 方法

1.2.1 引物设计:根据NCBI中比格犬ERβ转录本24(XM_861041.2)的mRNA序列设计一对引物，上游为 5'-ATGGATATCAAAAACTCTCC-3'，下游为5'-AGTGTCTCTCTGTTTACAG-3'，扩增片段长度为371 bp。引物送往生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 比格犬垂体组织总RNA的制备:取4只比格犬垂体组织约100 mg用于总RNA的提取:利用液氮与研磨器将样品研磨成粉末状，将粉末转移到DEPC处理过的1.5mL的离心管中，加入1mL的Trizol，然后按照试剂说明书提供的方法抽提总RNA。抽提的总 RNA取2.0 μL测定 A260/A280值分析纯度，同时进行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性。

1.2.3 RT-PCR:按TOYOBO cDNA合成试剂盒提供的方法进行cDNA合成和PCR扩增，用逆转录酶两步法合成cDNA第一条链，然后进行PCR，PCR扩增体积为 25 μL，体系如下:cDNA 1.0 μL，Premix LA Taq 12.5 μL，Sense primer(10 pmol/μL)1.0 μL，Antisense primer(10 pmol/μL)1.0 μL，Distilled H2O 9.5 μL。

PCR(降落PCR)反应程序:95℃预变性5 min;95℃ 变性 30 s，65℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，20 个循环，每个循环退火温度降低1℃;95℃变性30 s，45℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，20 个循环;最后 72℃延伸10 min。PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 雌激素β受体cDNA片段的克隆及DNA序列测定:PCR大量扩增目的基因后，1%凝胶电泳回收纯化PCR产物，采用BioFlux公司的胶回收试剂盒进行PCR产物的回收，将目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用蓝白筛选和菌液PCR法筛选及鉴定阳性重组子。在阳性重组子中随机挑选5个阳性克隆分别制备成甘油菌，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测序后，应用 NCBI BLAST及 DNA MAN对测序结果进行比对分析。

2 结果

2.1 比格犬垂体组织总 RNA的制备

按Trizol一步法从4只比格犬垂体组织中提取总 RNA，其 OD260/OD280值分别为 1.95、2.0、2.02、1.98，1%甲醛变性琼脂糖电泳(如图1)所示，可清晰见到18s和28s两条核糖体 RNA条带，说明所提取的总 RNA无明显的降解，是比较完整的。

2.2 RT-PCR扩增ERβ cDNA片段及其序列测定

分别以4只比格犬垂体总 RNA为模板进行反转录。RT-PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，如图2泳道所示，清晰可见2条片段的扩增条带。PCR产物用胶回收试剂盒回收后，连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用蓝白斑筛选、菌液PCR(如图3)鉴定阳性重组子，进行测序。

图1 总RNA的甲醇变性电泳Fig.1 Formaldehyde denaturalized lectrophoresis of total RNA

图2 雌激素受体β基因的扩增结果Fig.2 Amplification results of ER-β gene

图3 菌液PCR电泳图Fig.3 Electrophoresis of bacteria PCR

图4 ERβ序列比对Fig.4 The sequence alignment of the ER-β gene

2.3 正常及剪接异构体的序列比对

阳性菌液测序后，与 GeneBank中的比格犬ERβ序列比对，结果如图4.克隆得到的新异构体较已公布序列多57个碱基。

3 讨论

其他研究者以及我们前期的研究工作都表明，雌激素在动物的发情调控过程中发挥了重要的作用［3］。对小鼠、大鼠和人等动物的研究结果表明，雌激素的正负反馈调节与其受体在不同组织的表达差异、表达水平和表达时间密切相关［4］。雌激素受体(ER)有两种亚型，即 ERα和 ERβ。目前对许多动物ERα的基因结构及功能特点了解比较多，但对ERβ的了解相对较少，尤其对比格犬的 ERβ的研究则更少。本实验旨在克隆ERβ基因，明确ERβ在下丘脑-垂体-性腺轴的存在情况。实验结果显示ERβ基因PCR扩增结果电泳条带不单一，有两条带，原因可能为非特异性扩增，也可能是ERβ基因存在剪切异构体，根据大鼠、小鼠及人的相关 ERβ剪切异构体的研究发现，ERβ存在多种剪切异构体，所以我们以为扩增产物不单一的主要原因是比格犬ERβ基因可能存在剪切异构体，孔德强等［5］的研究结果证实了比格犬ERβ基因存在剪切异构体，经过验证目的带之外的电泳条带证实其为一种新的剪切异构体，但由于本实验只选了ERβ基因部分区段扩增，要想得到剪切体完整信息还有待进一步深入研究，为其在生殖活动中的功能研究奠定基础。

［1］Kutzler MA.Induction and synchronization of estrus in dogs［J］.Theriogenology，2005，64:766－775.

［2］Kobayashi M，Ishii H，Sakuma Y.Identification of novel splicing events and post-transcriptional regulation of human estrogen receptor α Fisoforms［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，333(1):55－61.

［3］孙兆增，曾林等.乙烯雌酚对间情期比格犬发情的诱导［J］.中国比较医学杂志，2008，18(11):36－38.

［4］Springwald A，Lattrich C，Skrzypczak M，Goerse R，Ortmann O，Treeck O.Identification of novel transcript variants of estrogen receptorα， β and progesterone receptor gene in human endometrium［J］.Endocrine，2010，37(3):415－24.

［5］孔德强，胡仲明等.一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析［J］.中国比较医学杂志，2011，7(11):44－47.

Cloning and Identification of a New Alternatively Spliced Variants of Beagles Estrogen Receptor β

REN Xiu-mei1，2，ZHAO Yan-bin2，SUN Zhao-zeng2，XU Qin3，BAI Jie-ying2，LIU Yi2，HU Zhong-ming2，JIN Zhao1，ZENG Lin2
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China;2.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China;3.Department of Laboratory Animals，Urumqi General Hospital，Lanzhou Military Districts，Urumqi 830000，China)

Objective To clone and identify alternatively spliced variants of beagles estrogen receptor β.Methods By RT-PCR analysis，we identified the existence of a new splice variant of beagles estrogen receptor β using Beagles pituitary organization as a template，to determine the existence of a new spliced variant by electrophoresis and cloned and sequenced.Results Using primers designed to get two obvious electrophoresis with sequencing showed that one of the missing splicing，this alternatively spliced variants has not been reported.Conclusion We get a new estrogen receptor β，this will help to study protein-coding function of a variety of estrogen receptor variable spliced and the role in the process of reproductive regulation.

Beagles;Estrogen receptor β;Cloning;Alternatively spliced variants

Q95-331;R332

A

1671-7856(2012)07-0036-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.010

2012-07-05

国家自然科学基金资助项目(31172164);十二五重大专项“高致病病源动物模型研究(2012ZX10004502)。

共同第一作者:任秀梅(1987－)，女，硕士生;研究方向:宠物医学;赵彦斌(1984－)，男，博士生;研究方向:实验动物学，E-mail:nmzhaoyanbin@126.com。

曾林(1965－)，男，研究员，博士生导师，研究方向:实验动物科学与管理，E-mail:zenglin1965@126.com;靳朝(1961－)，男，教授，硕士生导师，研究方向:宠物医学，E-mail:dwyy2008@163.com。