抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

赖心田 刘小青 洪晓明 陈国培 杨国武

(深圳市计量质量检测研究院 广东深圳 518131)

1 前言

近十几年来，随着转基因作物及其加工产品在数量和应用上的逐渐增多，转基因产品及其安全性受到了越来越多的关注［1］，同时也给转基因生物安全监管工作带来更大的挑战。不少国家已经对转基因食品进行了限量标识管理，我国也建立了转基因食品的标识管理目录，并纳入了检验检疫和质检部门的检测项目。

目前转基因大豆的检测主要是采用普通PCR和单重荧光定量PCR进行，然而随着TaqMan探针技术的发展［2，3］，多重定量 PCR不仅能节省样品及试剂，同时也能实现一管多检的高效率［4－6］。此外，进行转基因作物及其产品的PCR检测使用重组质粒，可以长期稳定保存并与目的基因保持较高同源性，因此，将检测的目的基因片段克隆到质粒载体中制备成阳性参照物，不仅可以使阳性参照物长期稳定保存，而且使检测结果的准确性得到很大的提高［7］。

由于抗草甘膦转基因大豆外源基因的检测包括3个部分:花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、胭脂碱合成酶的NOS终止子以及5－烯醇丙酮酸莽草酸 －3 － 磷酸合成酶基因 CP4 EPSPS［8］，因此，本研究旨在构建稳定、可靠、易制备和保存的抗草甘膦转基因大豆阳性标准分子，建立抗草甘膦转基因大豆的多重荧光PCR检测体系，实现一次PCR反应完成筛选和特异性检测的过程。

2 材料与方法

2.1 材料

转基因抗草甘膦大豆标准品为美国孟山都公司的RRS转基因大豆GTS40－3－2。实验所用的PCR引物和荧光探针由上海生工生物工程公司合成和标记，所用的分子生物学试剂均购自大连宝生物生物工程公司。

2.2 方法

2.2.1 RRS 外源基因片段克隆

取适量RRS转基因大豆标准品，研磨成粉状，采用CTAB法提取大豆基因组，用紫外分光光度计测量其含量，并稀释至50ng/μL作为PCR扩增模板。在PCR扩增中，利用连接引物、CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS引物将3个外源基因片段串联在一起并克隆至PMD－18T载体上，构建的质粒命名为PMD18T/SOY，并送上海生工测序。构建及检测中用到的引物［9］如表1所示。

表1 引物表

2.2.2 三重实时荧光PCR体系构建

CaMV35S，CP4 EPSPS，NOS 的荧光引物和探针序列［10］见表2。提取上述构建好的 PMD18T/SOY质粒，并用RNAse消化RNA后稀释至10ng为模板，同时设立空白对照，进行三重荧光PCR，引物和探针浓度均为20mmol/μL，通过调整Mg2+，酶的浓度，引物和探针的量，最终获得25μL如下的三重荧光的体系:2.5μL 10 × r － taq buffer，3μL dNTP 2ulMg2+，13.3μL ddH2O，0.4μL 各引物，0.2μL 各探针，0.2 μL r－ taq 酶，1μL 10ng/μL 质粒。荧光PCR的反应条件为:95℃，3min;95℃，15s;60℃，34s;40cycle。

表2 实时荧光PCR引物及探针表

2.2.3 三重荧光定量PCR的检测限值测定

以10ng/μL的PMD18T/SOY质粒进行10倍梯度稀释，质粒浓度分别为 10、1、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6ng/μL，采用 25μL 体系，体系同2.2.2，同时做阴性空白对照，进行三重荧光定量PCR检测限值的测定。

3 结果与分析

3.1 RRS外源基因片段克隆

通过设计的中间引物，将抗草甘膦转基因大豆的CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS 3个外源基因融合在一起，采用CaMV35S正向引物和NOS反向引物，以PMD18T/SOY质粒为模板经过PCR扩增后，产物扩增片段碱基理论长度应为549bp，检测结果见图1。

图1 PMD18T/SOY检测结果

图1 显示，扩增条带大小约为550bp，与理论长度一致。PMD18T/SOY质粒插入片断经测序分析与标准序列一致，证实PMD18T/SOY构建成功，可用于转基因定性检测及限值检测的阳性参照物。

3.2 三重实时荧光PCR体系建立及检测限值的测定

经过调整Mg2+、酶的浓度、引物和探针的量获得大于90%的高扩增效率和重复性一致的三重荧光PCR体系，采用构建好的 PMD18T/SOY质粒10ng为模板，获得的结果如图2所示。

图2 三重荧光PCR检测结果

从图2中可看出，CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS的Ct值接近，空白无污染，建立的三重荧光PCR体系适合对以该质粒为阳性参照进行的转基因定性检测。此外，以10ng/μL的质粒为母液，并进行10倍梯度稀释进行CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS三重荧光PCR检测限值分析，扩增曲线见图3。以质粒浓度的log值为横坐标，以Ct值为纵坐标，建立扩增基因的标准曲线图，见图4。

图3 三重荧光PCR CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS检测限值测定结果

图4 三重荧光PCR CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS基因标准曲线

图3 和图4显示，3个基因的荧光PCR每个循环呈等差的3－4Ct值增加，Ct值介于13－30之间，且这3个基因的荧光PCR检测限值均为10－3ng/μL，即能检测到1pg的DNA，灵敏度特别高。并且图4中CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS的r2值分别为0.998、0.999、0.999，这也说明梯度稀释的质粒模板扩增线性相关性非常好。

4 讨论

使用PMD18T/SOY作为参比分子时，构建的多重荧光定量PCR体系灵敏度极高，可对抗草甘膦转基因大豆进行定性和定量检测。但是，高灵敏度的同时也带来一定的风险性，如果有微量转基因物质气溶胶存在，则很容易造成污染，使空白在Ct值为30多时有峰扬起，因此，需严格控制荧光定量PCR体系配制区与模板加样区的隔离，避免气溶胶等的存在，从而避免出现假阳性。

欧盟联合研究中心标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM或者ERM)提供的抗草甘磷转基因大豆GTS40－3－2标准物质是 5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0%6个浓度梯度的种子粉末，由于不同种子在提取的DNA质量、纯度和复杂程度上很难保持一致，容易导致PCR扩增效率的差异，这都会对转基因成分定量分析的准确度产生一定的影响。此外，种子作为标准物质进行定量检测重复性难以控制，线性相关性也较差。在本研究中，将融合了抗草甘膦转基因大豆的CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS 3个外源基因的质粒PMD18T/SOY作为标准物质分子，并在此基础上建立多重荧光PCR，实现一管多检，定量检测未知样品时可稀释到10－6，检测限值达10－3ng/μL，线性关系良好且范围宽，作为参比分子非常精确，在建立的多重荧光PCR中，它的r2均在0.998以上。同时，作为标准分子的质粒可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，可提供无限稳定量的标准物质，一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，并且纯度较高。因此与常规的从生物公司购买标准品相比，此方案更具有操作性，更能保证目的片段的扩增效率，降低了转基因检测的成本。

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