高血压病血瘀证患者血清对血管内皮细胞活性的影响

胡小勤，陈利国，曾学文，戴勇，张敏

(1.广西中医学院，广西 南宁 530001;2.暨南大学医学院，广东 广州 510632;3.广东南海市中医院，广东 佛山 528200)

血瘀证与血管内皮细胞损伤密切相关［1］，因此通过体外实验观察血瘀证患者血清对人脐静脉内皮细胞CRL－1730活性的影响，并与非血瘀证患者血清的作用进行比较，可深入探讨血瘀证形成的病理机制。本实验研究了高血压病血瘀证患者血清对CRL－1730活性的影响。

1 材料

1.1 细胞来源 人脐静脉内皮细胞株(CRL－1730)由美国ATCC公司提供。

1.2 试剂 F12K培养基、内皮细胞生长因子(ECGS)(北京迈晨科技公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Gibco公司);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。

1.3 仪器 680型酶标仪(美国Bio－Rad公司)。

2 方法

2.1 血清来源 选取高血压病血瘀证和非血瘀证患者各20例，为2005年5月～2006年5月广州华侨医院门诊及住院确诊者。高血压病诊断符合世界卫生组织/国际高血压学会统一的诊断标准［2］。血瘀证诊断符合1986年中国中西医结合研究会制定的血瘀证诊断标准［3］。两组患者均为原发性高血压患者，排除靶器官损害或糖尿病。两组患者在性别、年龄、血压分级方面无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。健康组选择暨南大学本科生健康志愿者15人。其血压在正常范围，与高血压病患者血压比较，有统计学差异(P ＜0.01)。

2.2 血清收集 高血压病血瘀证患者、非血瘀证患者及健康人均空腹取血，置入不抗凝干燥试管，自凝后以2 000r/min离心(4℃，15min)，取上清液置无菌 EP管，冻存于－20℃，备用。用于体外细胞实验的血清分别为各组患者的混合血清。

2.3 分组

2.3.1 对照组 100%DMEM。

2.3.2 血瘀组 分别为5%，10%，15%，20%血瘀证患者血清(DMEM稀释)。

2.3.3 非血瘀组 分别为5%，10%，15%，20%非血瘀证患者血清(DMEM稀释)。

2.3.4 健康组 分别为5%，10%，15%，20%健康人血清(DMEM稀释)。

2.4 细胞接种及活性观察 按1×105个/mL密度接种于96孔培养板中，100μL/孔。培养24h后，换无血清培养液再培养24h，按血瘀组、非血瘀组、健康组各4组(5%，10%，15%，20%)及对照组分组，每组8个复孔，继续分别培养 6，12，24，48h 后，每孔加入 20μL MTT(5g/L)，孵育 4h，倾去上清液，每孔加 DMSO 150μL，振荡10min，全自动酶标仪于570nm处测定吸光度(A)。以空白对照孔调零。

3 结果

MTT法检测细胞活性，不同浓度血清作用于CRL－1730不同时间后细胞活性比较，见表1～4。

表1 血清作用CRL－1730 6h后细胞活性比较(±s，n=8)

表1 血清作用CRL－1730 6h后细胞活性比较(±s，n=8)

注:与健康组比较，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A组别20% 15% 10% 5%血瘀组 0.68 ±0.142)0.66 ±0.062) 0.73 ±0.06 0.77 ±0.102)非血瘀组 0.76 ±0.062)0.61 ±0.072) 0.73 ±0.03 0.72 ±0.082)健康组1.01 ±0.16 0.92 ±0.06 0.98 ±0.09 1.12 ±0.03

由表1可见，血清作用6小时后，血瘀组、非血瘀组与健康组比较，20%，15%和5%浓度时差异显著(P＜0.01);血瘀组与非血瘀组比较，无统计学差异。

表2 血清作用CRL－1730 24h后细胞活性比较(±s，n=8)

表2 血清作用CRL－1730 24h后细胞活性比较(±s，n=8)

注:与健康组比较，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A组别20% 15% 10% 5%血瘀组 0.86 ±0.11 0.88 ±0.182)0.98 ±0.052)0.93 ±0.072)非血瘀组 0.95 ±0.10 0.90 ±0.172)1.01 ±0.032)1.05 ±0.131)健康组0.99 ±0.10 1.32 ±0.08 1.51 ±0.17 1.94 ±0.14

表3 血清作用CRL－1730 48h后细胞活性比较(±s，n=8)

表3 血清作用CRL－1730 48h后细胞活性比较(±s，n=8)

注:与健康组比较，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A组别20% 15% 10% 5%血瘀组 1.11 ±0.08 1.37 ±0.021) 1.40 ±0.13 1.38 ±0.072)非血瘀组 1.23 ±0.10 1.35 ±0.041) 1.44 ±0.04 1.42 ±0.102)健康组1.23 ±0.05 1.57 ±0.03 1.47 ±0.07 1.83 ±0.06

由表2可见:血清作用24小时后，血瘀组、非血瘀组与健康组比较，15%，10%和5%浓度时差异显著(P＜0.05或P＜0.01);血瘀组与非血瘀组比较，无统计学差异。

从表3可见，血清作用48小时后，血瘀组、非血瘀组与健康组比较，15%和5%浓度时差异显著(P＜0.05或P＜0.01);血瘀组与非血瘀组比较，无统计学差异。

总的来说，血清作用6h后，血瘀组、非血瘀组与健康组比较，细胞活性较低，20%，15%和5%浓度时差异显著(P＜0.01);血清作用24h后，血瘀组、非血瘀组与健康组比较，细胞活性较低，15%，10%和5%浓度时差异显著(P＜0.05或P＜0.01);血清作用48h后，血瘀组、非血瘀组与健康组比较，细胞活性较低，15%和5%浓度时差异显著(P＜0.05或P＜0.01);各浓度血清作用6，24，48h后，血瘀组与非血瘀组比较，均无统计学差异，但血瘀组细胞活性较非血瘀组有降低的趋势。

4 讨论

本研究发现，血清作用24，48h，血瘀组、非血瘀组细胞活性较健康组低，在某些浓度时差异显著(P＜0.05或 P ＜0.01)，与文献报道结果一致［4－5］。本研究也说明，血瘀证患者血清可以降低血管内皮细胞的活性，但要选择合适的作用时间及合适的浓度。而血瘀组和非血瘀组比较，无统计学差异，但血瘀组细胞活性较非血瘀组有降低的趋势，说明高血压病患者血清可以降低内皮细胞的活性，对细胞的代谢与增殖有抑制作用。其中，血瘀证患者血清对细胞活性的抑制有更明显的趋势。之所以还没有统计学差异，可能是因为血清的作用没有持续，下一步如果对损伤的细胞进行传代，并继续用血清进行干预，可能会得出不一样的结论。

［1］ 李晓，姜萍.血管内皮细胞损伤与血瘀证［J］.中国中西医结合杂志，2000，20(2):154 －156.

［2］ Chalmers J，Chusid P，Cohan JN，et al.WHO － ISH hypertension guidelines committee.1999 world health organization － international society of hypertension guidelines for the management of hypertension［J］.J Hypertension，1999，17:151 －183.

［3］ 中国中西医结合研究会活血化瘀专业委员会.血瘀证诊断标准［J］.中西医结合杂志，1987，7(3):129.

［4］ 李正飞，郝斌，杨涛，等.氟伐他汀对抗磷脂综合征患者血清诱导人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子－1表达的影响及机制［J］.中国药物与临床，2010，10(4):418.

［5］ 李小丽，甘华，常晓东，等.尿毒症患者血清对内皮细胞凋亡的影响及rhEPO的干预作用［J］.第三军医大学学报，2009，31(22):2255.