ATF4基因在小鼠胚胎围着床期子宫内膜的表达

柴路维，姜 蓉，何小茜，黄 燕，杨 戎

(重庆医科大学干细胞与组织工程研究室生理教研室，重庆400016)

转录激活因子4(activating transcription factor4，ATF4)是ATF家族的一员，该家族识别顺式作用转录增强子cAMP效应元件，是一种包含Jun和Fos结合位点的DNA结合蛋白，属于较大的碱性白氨酸链超家族［1］。近年来发现它能使肿瘤细胞在乏氧或其他应激的肿瘤微环境中促进细胞存活，启动细胞增殖，抑制细胞凋亡，在多种恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用［2-5］。此外，ATF4能诱导同一信号通路的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的转录［6］，而 VEGF 已证实在着床过程中起重要作用［7］。鉴于胚胎植入过程与肿瘤侵袭转移过程的相似性以及目前对ATF4在胚胎植入方面的作用未见报道，本研究旨在探讨ATF4在早孕小鼠子宫内膜的表达规律和在胚泡着床过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

标本的收集:清洁级昆明种系小鼠，6～8周龄，体质量25～30 g［由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(渝)20050002］。按雌雄2∶1自然合笼，次晨发现阴栓者记为妊娠1 d。随机将小鼠按妊娠天数分为 8 组(分别为0、1、2、3、4、5、6 和7 d)，每组20只，各组小鼠到时点后尾静脉注射台盼蓝0.2 mL，15 min后脱颈处死，取出子宫刮取除胚泡外的双侧子宫内膜。另取每组8只小鼠，取子宫立即放入4% 多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片(4 μm)备用。

1.2 主要试剂

RT-PCR试剂 (TaKaRa公司);一抗 (兔抗小鼠ATF4抗体) (Proteintech Group公司);二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG)(Santa cruz公司);免疫组化试剂盒 (北京中山生物公司);蛋白提取试剂盒 (凯基公司)、化学发光检验试剂盒ECL(上海碧云天公司)。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR:按试剂盒说明提取总RNA，判定RNA纯度及浓度;取部分RNA凝胶电泳，确定其完整性。RT-PCR引物由上海生工设计合成。ATF4基因(NM009716)上游引物:5'-CAAAACAAGACAG CAGCCACTA-3'，下游引物:5'-CTTCTTCCCCCTTGC CTTAC-3'，扩增片段长度为186 bp;内对照引物β-actin基因上下游引物分别为:5'-CCTGAGGCTC TTTTCCAGCC-3'，5'-TAGAGGTCTTTACGGATGTCA ACGT-3'，扩增片段长度为110 bp。严格按照产品说明操作:将总 RNA先反转录为cDNA。20 μL PCR反应体系，先94℃变性4 min，然后进入循环:94℃变性30 s，57 ℃ 退火45 s，72℃ 延伸30 s，循环 35次，最后再延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，图像分析仪扫描分析并摄像。用Quantity one 4.0软件分析各条带吸光度值/mm2，计算各组吸光度比值。

1.3.2 免疫组织化学:常规石蜡包埋子宫组织，制备切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，一抗ATF4工作浓度1∶200，操作过程均按组织化学染色试剂盒说明进行。棕黄色为阳性结果。

1.3.3 Western blot:按照试剂盒说明操作，常规裂解组织获取总蛋白、测定蛋白浓度。等量上样PAGE分离，PAGE分离蛋白用10%的分离胶，5%积层胶;将PAGE分离的蛋白转到PVDF膜上;加入一抗、二抗。以ECL化学发光试剂在X线胶片上曝光、显影、定影。以 GAPDH为内参。用 Quantity One4.0软件分析成像图谱，计算各组小鼠子宫内膜ATF4蛋白的比值。

1.3.4 在体实验:将16只妊娠d3的小鼠随机分为两组:实验组(8只)，麻醉后于腹部切一1 cm切口，向左侧宫角内注射5 μL ATF4抗体(稀释浓度1∶150)，右侧子宫角注射5μL 0.9%氯化钠注射液对照，缝合切口，饲养至孕8 d脱颈处死，剖腹观察双侧子宫胚胎着床数。另外8只孕3 d鼠作为对照组，双侧子宫角均注射0.9%氯化钠注射液。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 RT-PCR产物定性与半定量分析

妊娠各组小鼠子宫内膜ATF4 mRNA的表达量均显著高于未孕组0 d(P＜0.05)，总体表达呈先增高再下降的趋势，其中妊娠4 d表达最强(图1，表1)。

图1 RT-PCR检测ATF4 mRNA在妊娠0～7 d天小鼠子宫内膜的表达Fig 1 The expression of ATF4 mRNA in endometria of mice from 0 day to 7 days by RT-PCR

表1 各组小鼠ATF4/β-actin吸光灰度比值Table 1 Ratio of ATF4/β-actin in each group(x ± s，n=5)

2.2 免疫组织化学结果

ATF4在妊娠0～7 d腺上皮细胞、腔上皮细胞呈弱阳性表达;0～2 d基质细胞几乎无表达，但从3 d表达量逐渐增多且随妊娠的天数增加，于4 d达到高峰，随后逐渐下降(图2)。

2.3 Western blot结果

在围着床期表达的是50 ku的ATF4。妊娠各组表达显著高于未孕组0 d;4 d表达量最高(P＜0.05)(表1，图3)。

2.4 在体实验结果

实验组左右侧子宫胚泡着床数分别为2.4±0.9和7.0±1.6;对照组左右侧子宫胚泡着床数分别为6.8±0.8和6.2±1.3;实验组注射ATF4抗体的左侧胚胎着床数较右侧明显减少(P＜0.01)。对照组左右侧胚泡着床数无明显差异(图4)。

3 讨论

ATF4是一种应激诱导转录因子，近期研究表明，肿瘤组织局部低氧，ATF4高表达。缺氧时，蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinaseR-likeER kinase，PERK)被激活，通过磷酸化真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α，eIF2α)抑制蛋白质合成并活化ATF4，继而上调C-EBP同源蛋白(C-EBP homologous protein，CHOP)基因表达，启动细胞增殖，使细胞适应肿瘤缺氧环境［8-9］。另外ATF4可诱导下游基因VEGF高表达，抑制细胞的凋亡促进肿瘤进展［6］。胚胎植入过程与肿瘤的侵袭转移过程极为相似，且已有研究证实VEGF在着床中起重要作用［7］，因此本实验旨在探讨ATF4在胚胎植入过程中的作用。

图2 ATF4在妊娠0～7 d小鼠子宫的表达Fig 2 Expression of ATF4 in mouse uterus during pregnancy 0～7 days(×400)

本实验结果表明，妊娠早期各组小鼠子宫内膜ATF4 mRNA和蛋白的表达均显著高于未孕组0 d，随妊娠天数的增加表达量逐渐增多，于4 d达高峰，之后逐渐下降。另外，组化结果显示ATF4蛋白主要在基质细胞胞质中表达，且在胚胎着床期明显增加。

胚胎的成功植入与蜕膜细胞不断增殖、凋亡处于动态平衡有重要联系［10］。本实验，ATF4在3～6 d的基质细胞表达量随妊娠天数的增加而逐渐增多之后下降，与着床前蜕膜化进程同步，表明ATF4可能是参与蜕膜化进程的一个重要因子。一方面可能与孕早期滋养层绒毛在发育过程中处于相对缺氧状态，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路被激活，CHOP表达上调，促使基质细胞增生并向蜕膜细胞转化有关;另一方面这一时期ATF4信号级联反应被激活促使VEGF高表达，使血管通透性增强，进而抑制蜕膜细胞过度凋亡，为植入做准备:这提示ATF4可能通过下游基因VEGF的作用增强子宫内膜容受性。

为了进一步探讨ATF4在着床过程中的作用，本研究应用子宫角注射ATF4抗体进行功能研究［11-12］。结果显示ATF4抗体对胚泡着床有明显的抑制作用，表明ATF4可能是一种在胚胎植入中起重要作用的细胞因子，但本实验中ATF4抗体并不能完全抑制胚胎着床，是因为着床过程受多种细胞因子的调节，而这个复杂的过程中ATF4并非是唯一的因素。

总之，本研究结果显示，ATF4在小鼠围着床期子宫内膜呈时空特异性表达，提示ATF4可能参与子宫内膜蜕膜化过程，在胚泡早期植入中发挥作用。但其具体作用机制尚需进一步研究。

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