促红细胞生成素预处理对氧糖剥夺后星形胶质细胞水肿及AQP4表达的影响☆

唐兆华 廖正步 支兴刚 谢延风 石全红 何朝晖 詹彦

脑水肿是颅脑创伤、缺血性脑卒中等众多神经系统疾病共同的病理过程。颅脑疾病常常伴发的神经细胞缺血缺氧则是引起脑水肿的最重要病理基础之一。促红细胞生成素是血液系统主要的造血因子。近年国内外及本课题组前期的体外研究发现，重组人促红细胞生成素(recombinanthuman erythropoietin，rhEPO)在神经系统中具有减轻创伤性脑水肿等重要的神经保护功能[1-4]。新近研究显示水通道蛋白 4(aquaporin4，AQP4)是中枢神经系统最丰富的水通道蛋白，在脑内水电解质平衡的调节上发挥着重要作用[5-6]，而且已有最新研究表明rhEPO可以调节AQP介导的体外星形胶质细胞水通透性的改变[4]。星形胶质细胞是脑组织中占绝大多数比例的神经细胞，它的水肿会造成严重的脑损害[7]。所以，本研究旨在观察rhEPO预处理对氧糖剥夺后星形胶质细胞水肿及其AQP4表达的影响，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 新生2 d内的SD大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供)50只，胎牛血清(美国Gibco)，无糖DMEM培养基(中国 钮因华信)，神经胶质原纤维酸性蛋白(美国Sigma)，乳酸脱氢酶试剂盒(美国 Hyclone)，RT-PCR试剂盒(美国 Ferments)，AQP4 多克隆抗体(美国 Santa Cruz)。

1.2 星形胶质细胞原代培养[8]取新生2 d内的SD大鼠，取大脑皮层剪碎并消化后，接种到培养瓶中，置于37℃，20%O2的孵箱1 h，将细胞悬液换至有多聚赖氨酸涂底的培养瓶，隔2 d换液，7 d后 37℃，180 r／min 水平振荡 10 h，换液，细胞长满至95%瓶底后传代，待培养至第三代时，用特异性GFAP对星形胶质细胞行免疫荧光染色，鉴定成熟、纯化的星形胶质细胞。

1.3 氧糖剥夺模型的建立[9]去掉星形胶质细胞的含血清的DMEM／F12培养基，用PBS冲洗 2次，换为未添加血清的无糖DMEM培养基，置于1%O2的孵箱(美国 Thermo)行5 h时长的氧糖剥夺，此后再给细胞换回含血清的DMEM／F12培养基，并于20%O2的孵箱行复氧培养，至0.5 h、2 h、8 h、24 h四个时间点时进行观察及实验。

1.4 实验分组 将星形胶质细胞分为3个组：①正常组，未行氧糖剥夺及rhEPO预处理的星形胶质细胞；②模型组，未经rhEPO预处理，直接行氧糖剥夺的星形胶质细胞；③rhEPO预处理组，先在星形胶质细胞的正常培养基中加入1IU／mL rhEPO

作用2 h后，再对其进行氧糖剥夺(在0.1、1和10 IU／mL三种浓度的预实验中1IU／mL rhEPO保护作用最强)。每个分组在每个时间点均有3～5个随机抽样的独立样本。

1.5 星形胶质细胞形态观察 用光学显微镜(德国Leica)直接观察氧糖剥夺并复氧培养至各时间点细胞的形态变化。

1.6 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定 各组星形胶质细胞分别在氧糖剥夺后复氧培养至各时间点进行LDH活性测定，取每孔细胞培养液约0.3 mL，按照乳酸脱氢酶试剂盒说明书操作，测试样品中LDH的活性，LDH漏出率＝培养基LDH×100%／(胞浆LDH+培养基 LDH)。

1.7 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测星形胶质细胞AQP4 mRNA的表达 按Trizol试剂说明提取细胞总RNA，采用MMLV逆转录试剂盒按操作说明逆转录为cDNA，产物进行PCR。AQP4引物： 上游 5′CCTACAGAACCAAGGCGTAA3′，下游5′TCCCTGGAAATGACTGAGAA3′，扩增片段长 261 bp；β-肌动蛋白(β-actin)引物：上游 5′ACCTCCAACACCCCAGCCATG3′，下游 5′CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG3′，扩增片段长 691 bp。反应体系25 μL，58℃退火 45 s，共循环30次。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，长波紫外灯下观测照相。用Quantity One软件分析电泳条带平均光密度值，AQP4／β-actin积分A值为AQP4 mRNA表达水平。

1.8 Western Blot法检测星形胶质细胞AQP4蛋白的表达 分别消化各组在不同时间点的细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解20 min，测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，沸水变性5min。每孔加入40 μg蛋白样品电泳，用PDVF膜转膜，封闭后加一抗AQP4(1∶300)，4℃孵育过夜，加入 HRP 标记的二抗，37℃孵育1 h，ECL显影，GAPDH作为内对照参数。用Quantity One软件分析荧光条带平均光密度值，AQP4／β-actin积分 A值为 AQP4蛋白表达水平。

1.9 统计学分析 计量资料采用均数±标准差表示，采用SPSS 13.0进行分析，组间比较均采用单因素方差分析，两两比较均采用Turkey法，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 星型胶质细胞的原代培养及鉴定 光学显微镜下可见原代成熟的星形胶质细胞成片生长，形态较扁而大，呈多边不规则形，有细长突起，细胞间连接紧密(图1 A)。对培养成功的原代星形胶质细胞，用特异性GFAP抗体进行免疫荧光染色鉴定，荧光显微镜下见荧光阳性细胞比例＞98%，满足后续实验要求(图1 B)。

2.2 光学显微镜观察星形胶质细胞形态改变 模型组星形胶质细胞在5 h氧糖剥夺后复氧培养至0.5 h时，出现边缘皱缩，折光率增高，胞体略增大，胞内形成较多颗粒样物质，至2 h时形态变化加重，细胞明显肿胀变圆，折光率明显增高，突起增粗缩短，少量细胞呈凝固性坏死，8 h时肿胀的细胞稍有缓解，部分坏死细胞已脱落悬浮，细胞数量减少，至24 h时肿胀虽有所缓解，但较正常细胞仍有明显肿胀(图2 A～D)。

rhEPO预处理组星形胶质细胞在5 h氧糖剥夺后复氧培养至0.5 h时胞质内出现少量颗粒样物质，至2 h时细胞边缘皱缩，轮廓加强，仅部分胞体及足突轻度肿胀，折光率增高，但形态变化明显轻于模型组，至8 h时细胞肿胀减轻，未见明显坏死细胞，24 h时大部分细胞基本恢复扁平、多边形，有细长突起的正常形态(图2 E～H)。

2.3 星形胶质细胞LDH漏出率变化 LDH漏出率在5 h时长的氧糖剥夺后，随着时间延长，呈不断增高趋势(24 h时：F＝80.45，P＜0.01)。 与正常组相比，模型组LDH漏出率氧糖剥夺后24 h时增加最多(P＜0.01)；与模型组相比，rhEPO预处理组LDH漏出率在5 h时长的氧糖剥夺后24 h时的增高趋势有明显降低(P＜0.01)，见表1。

2.4 RT-PCR法检测 AQP4 mRNA的表达变化正常组星形胶质细胞有一定量的AQP4 mRNA表达；与正常组比较，模型组细胞AQP4 mRNA在5 h氧糖剥夺并复氧培养至0.5 h时表达有所下降(P ＝ 0.041)，2 h时回升(P ＝0.381)，至 8 h时明显高于正常并达最高值(P＜0.01)，24 h时有所下降，但仍明显高于正常水平(P＜0.01)；与模型组比较，rhEPO预处理组AQP4 mRNA在氧糖剥夺后的表达变化趋势与模型组相似，但在各个时间点的表达水平均有明显降低(8 h时：P＜0.001)，见图 3，表2。

图1 原代成熟的星形胶质细胞(A光学显微镜)及其鉴定(B细胞免疫荧光)

图2 rhEPO预处理对5 h氧糖剥夺后星形胶质细胞形态的影响。

2.5 Western Blot法检测AQP4蛋白的表达变化正常组星形胶质细胞有一定量的AQP4蛋白表达；与正常组相比，模型组细胞AQP4蛋白在5 h氧糖剥夺并复氧培养至 0.5 h时表达先下降(P＝0.021)，2 h 时回升(P ＝ 0.527)，至 8 h 时明显高于正常组(P ＜ 0.01)，24 h 时达最高值(P ＜ 0.01)；rhEPO预处理组AQP4蛋白在5 h氧糖剥夺后的表达变化趋势与模型组相似，但在各个时间点的表达水平均有明显降低(24 h 时：P ＜ 0.01)，见图3，表2。

3 讨论

近二十年来，研究发现EPO及其受体广泛存在于中枢神经系统中[10]，在病理条件下发挥了各种重要的神经保护功能。最新研究表明rhEPO可以明显减轻大鼠颅脑创伤后的脑水肿[2]和大鼠冻伤模型中的血管源性脑水肿[11]，并且能够很好地保护血脑屏障的完整性[12]。Gunnarson等在体外低渗模型及兴奋性氨基酸模型中发现，rhEPO能明显降低野生原代星形胶质细胞水通透性的上调，但在AQP4敲出的原代星形胶质细胞中则无上述作用[4]。目前，rhEPO减轻脑水肿的具体途径及机制目前都尚不清楚。所以，本研究观察rhEPO预处理后对体外星形胶质细胞水肿模型中AQP4表达的影响，探讨EPO减轻脑水肿是否是通过调节AQP4的表达来实现的。

体外氧糖剥夺模型可引起星形胶质细胞胞体和突起明显肿胀，能模拟体内颅脑创伤等神经系统疾病中星形胶质细胞因缺血再灌注损伤引起细胞毒性脑水肿这一重要病理过程。本实验中，星形胶质细胞在5 h氧糖剥夺后，细胞逐渐肿胀，2 h至8 h时达到肿胀高峰，至24 h时肿胀仍未消退，期间有大量细胞坏死，LDH活性的不断增高也印证了星形胶质细胞严重损伤的表现。而在氧糖剥夺前加入rhEPO预处理，能使细胞的肿胀明显减轻，且在复氧后24 h时，肿胀的细胞形态已基本恢复正常，坏死细胞明显减少，LDH活性增高的程度也同样明显降低。上述结果表明rhEPO预处理能够明显减轻5 h氧糖剥夺引起的星形胶质细胞水肿。

表1 rhEPO预处理对5 h氧糖剥夺后星形胶质细胞LDH漏出率的影响

图3 rhEPO预处理对5 h氧糖剥夺后各时间点星形胶质细胞AQP4 mRNA和蛋白表达的影响

表2 rhEPO预处理对5 h氧糖剥夺后AQP4 mRNA和蛋白表达的影响

AQP4是脑内主要的水通道蛋白，在国内外研究及本课题组的前期研究当中发现，它与脑水肿的形成及转归均密切相关。Papadopoulos等人在细胞毒性脑水肿模型发现中，AQP4敲除小鼠的脑水肿程度明显轻于野生小鼠[13]。Thrane等人发现AQP4敲除鼠可减轻低渗液引起的星形胶质细胞肿胀[14]。而Yang等人发现在过表达AQP4小鼠中，其细胞毒性脑水肿则较野生型小鼠更加严重[15]。由此可见，AQP4表达水平的高低与细胞毒性脑水肿的严重程度呈正相关。

在5 h氧糖剥夺后星形胶质细胞严重水肿的过程中，AQP4 mRNA和蛋白的表达量在短时下降后，呈上升趋势。而在加入rhEPO预处理后，AQP4 mRNA和蛋白的表达在星形胶质细胞氧糖剥夺后各个时间点较模型组均明显降低，细胞水肿也明显减轻。AQP4在氧糖剥夺后短时下降可能是细胞保护性下调，或者因氧糖剥夺导致的细胞能量障碍，使其蛋白合成能力降低所致。而经rhEPO预处理后，氧糖剥夺后星形胶质细胞AQP4的表达水平明显降低，由此可以阻止细胞水肿过程中胞外水分异常过多的进入细胞内，从而达到减轻5 h氧糖剥夺后星形胶质细胞水肿的作用。

EPO调节AQP4表达，减轻氧糖剥夺后星形胶质细胞水肿的作用，为临床创伤性脑水肿、颅内瘤周脑水肿等脑水肿的治疗提供了新的思路。最新研究表明，EPO可通过调节ERK信号通路的活化减轻创伤性脑水肿，起到神经系统保护的作用[16]，但其具体分子机制研究有待于我们进一步的研究来探讨。

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