熊胆降热丸中儿茶素在大鼠体内的药代动力学研究

季 平，袁浩宇，林 勇，易 红，王 鹏

(核工业四一六医院，四川 成都 610051)

熊胆降热丸是由熊胆、儿茶、大黄等七味中药组方的复方制剂，具有清热、解毒、通便等功效。儿茶素(catechin)为儿茶的主要成分，别名儿茶酸，为黄烷衍生物，具有防治心血管疾病、预防癌症等多种功能[1－5]。目前，国内外对儿茶素类化合物的体内研究多集中在儿茶素体内代谢方面，也有少量关于儿茶素单体、表儿茶素单体或儿茶素脂质体经口服或静脉注射给药后在家兔、大鼠体内代谢研究的报道[6－9]，尚无儿茶中药复方制剂中的儿茶素体内代谢研究的报道。笔者对大鼠口服熊胆降热丸后儿茶素的药代动力学进行了研究，为含儿茶中药复方制剂的体内研究和临床合理用药提供参考。

1 仪器与试药

LC－10ATvp型高效液相色谱仪(日本岛津);SPD－10Avp型紫外检测器;BS224S万分之一电子天平(德国赛多利斯);pHS－3C型酸度计(成都方舟科技开发公司);LD4－2型台式离心机(北京医用离心机厂);YHK－Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。熊胆降热丸(四川大学药学院药剂教研室，规格为0.1 g，批号为061001)，儿茶素对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为110877－200602);乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。健康SD大鼠，体重250～300g，由四川大学华西动物中心提供，动物合格证为SCXK(川I)10－2006。试验前适应性喂养1周。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil C18柱(250mm×4.6mm，10μm);流动相:乙腈－水－三乙胺(6 ∶94 ∶0.3，磷酸调节 pH=(4.0 ±0.1);检测波长:205 nm;柱温:40℃;流速:1mL/min。

2.2 溶液制备

精密称取儿茶素对照品适量，用甲醇溶解成含儿茶素240mg/L的对照品贮备液，于冰箱－20℃贮存，4周内使用，临用前用甲醇稀释至所需浓度。取熊胆降热丸10粒，研细，称取细粉约0.3 g，置圆底烧瓶中，加水25mL浸泡24 h后于80℃水浴加热1 h，过滤，取滤液，测定出提取液中儿茶素的浓度，作为熊胆降热丸供试品溶液。

2.3 血样处理方法

取血浆样品 100μL，甲醇 －饱和硫酸锌(1∶1)200μL，漩涡混合1min，以10 000 r/min的速度离心5min，精密量取上清液50μL注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以外标法将测量值带入随行工作曲线，计算血浆中儿茶素的浓度。

2.4 方法学考察

专属性考察:空白血浆、空白血浆加对照品、用药后血浆样品色谱图见图1。结果儿茶素在23.0 min左右出峰，峰形良好，血浆中内源性成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

标准曲线制备:于100μL空白大鼠血浆中，加入不同浓度儿茶素对照品溶液 20μL，制成含儿茶素质量浓度依次为 0.12，0.24，0.48，1.2，2.4，4.8，9.6 mg/L 的溶液，照拟订方法记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标、儿茶素质量浓度(C)为横坐标进行线性回归，得回归方程 A=9.561 ×103C+83.6，(r=0.999 2)，定量限为 0.12 mg/L。结果表明，儿茶素在 0.12 ～ 9.6mg/L质量浓度范围内，与峰面积线性关系良好。

回收率和精密度试验:以空白血浆配制低、中、高(0.24、1.2和4.8mg/L)3个质量浓度的儿茶素标准系列各5份，按2.3项下方法操作，计算日内、日间变异系数，评价方法的精密度和准确度;以流动相代替空白血浆，制备低、中、高 (0.24，1.2，4.8 mg/L)3个质量浓度的儿茶素标准品溶液，按2.3项下方法操作，以血浆样本与纯品中儿茶素的峰面积比值计算提取回收率。结果低、中、高(0.24、1.2 和 4.8mg/L)3 个浓度的血浆样品的日内及日间变异均低于15%，回收率为90.2% ～97.1%。见表1。

稳定性试验:配制低、中、高(0.24，1.2，4.8mg/L)3 个质量浓度血浆样品各3份;取1份，按2.3项下方法操作，分别于室温下放置0，2，4，6 h后测定，考察样品处理后在室温条件下的稳定性;1份放置于－20℃ 冰箱中，反复冻融3次，考察反复冻融对药物的影响;另1份在－20℃冰箱冷冻30 d后，考察药物在冷冻时放置的稳定性。结果测定值的 RSD均小于10%，表明血浆样品室温下放置6 h、反复冻融和－20℃冰箱中冷冻保存30 d后稳定性均良好。

表1 精密度、准确度和提取回收率结果(n=5)

2.5 动物试验

取8只大鼠，雌雄各半，在试验前适应性喂养7 d。试验前12 h禁食，全程不禁饮;灌胃给予熊胆降热丸供试液，于给药前及给药后 0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，10，12，24 h 尾静脉断尾取血，分取血浆，置－20℃冰箱中保存待测。血药浓度－时间曲线见图2。用DAS2.0药代动力学计算程序进行处理，计算药代动力学参数。结果儿茶素在大鼠体内过程符合二室模型，药代动力学参数见表2。

图2 儿茶素均值血药浓度－时间曲线(n=8)

表2 儿茶素口服给药后的药代动力学参数(n=8)

3 讨论

大鼠单剂量口服熊胆降热丸提取液(相当于儿茶素50mg/kg)后，儿茶素在体内的处置符合二室模型，约0.5 h达峰，吸收迅速;消除半衰期较慢，为(7.779±4.568)h;中心室分布容积为(19.635 ±8.632)L/kg，远大于大鼠的体液总体积，说明分布广泛。

对儿茶素对照品溶液(10μg/mL)进行紫外扫描(200～400nm)。结果儿茶素在280 nm波长处有吸收峰，在205 nm波长处有较强的末端吸收，其吸收强度约为前一波长处的2倍。故为提高体内分析的灵敏度，选择205 nm为儿茶素血药浓度的测定波长。

儿茶素母核上的氧原子和酚羟基与十八烷基硅烷键合硅胶上的残余硅醇基可形成氢键，使色谱峰拖尾，加入三乙胺使峰的对称性得到改善，三乙胺浓度为0.3%时最佳。在确定蛋白质沉淀剂时，笔者考察了3种蛋白沉淀剂:甲醇、乙腈、甲醇－饱和硫酸锌溶液(1∶1)，使用甲醇－饱和硫酸锌(1∶1)时，儿茶素的药物释出率最高，可能是因为当溶液pH＞p I时，蛋白质易与重金属离子结合成不溶性的蛋白盐而沉淀。

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