软脂酸制备3T3－L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的方法1）

陈思思，王 彦，杨 静，陈显久

胰岛素抵抗（IR）是胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种代谢状态。胰岛素与细胞表面受体的结合或胰岛素信号在胞内的传递过程中，任何一个信号转导环节受到抑制均有可能引起IR［1］。研究表明在肥胖者体内血浆游离脂肪酸（FFA）的水平是增高的［2］，血浆高水平的FFA显著影响外周组织细胞，特别是脂肪细胞对胰岛素的敏感性，使脂肪细胞糖代谢功能障碍，导致IR［3］。因此，FFA在IR发病过程中的作用已成为近年来研究的热点，但用FFA制备体外细胞IR模型无论方法还是剂量目前还未达成共识。软脂酸（PA）是FFA的一种，本实验旨在探讨用PA制备3T3－L1脂肪细胞胰岛素抵抗（IR）模型的方法。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 3T3－L1前脂肪细胞株由山西医科大学第一医院内分泌实验室冻存。高糖DMEM培养基购自Gibco－BRL（公司；胎牛血清（FCS）购自杭州四季青生物有限公司；3－异丁基－1－甲级黄嘌呤（IBMX）、甲状腺素（T4）、不含游离脂肪酸的BSA（FAF BSA）、牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亚砜（DMSO）、PA均购自Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及诱导分化 参考文献［4］的方法进行3T3－L1前脂肪细胞的培养及诱导分化操作：在37℃、5%CO2的条件下，3T3－L1前脂肪细胞在含有10%FCS的高糖DMEM中培养，待细胞融合2d后，加入含有0.5mmol／L IBMX、0.25 μmol／L地塞米松、0.2nmol／L甲状腺素、250nmol／L胰岛素和10%FCS的高糖DMEM培养4d，期间换液1次，然后换上含有0.25μmol／L地塞米松、0.2nmol／L甲状腺素、250nmol／L胰岛素和10%FCS的高糖DMEM培养，2d换液1次，诱导分化8 d～12d的3T3－L1前脂肪细胞90%～95%呈脂肪细胞表型。用油红O染色鉴定［5］，细胞可用于实验。

1.2.2 油红O染色鉴定3T3－L1脂肪细胞 油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。步骤如下：吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL／孔，室温固定1h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。

1.2.3 不同浓度的PA干预3T3－L1脂肪细胞 参考文献［6］的方法溶解PA。将3T3－L1前脂肪细胞接种于6孔板，诱导分化成熟后，换上含有0.2%的FAF BSA的高糖DMEN无血清培养基过夜。依据PA不同浓度分为0mmol／L PA组（对照组）、0.25mmol／L PA 组、0.5mmol／L PA 组、1.0mmol／L PA组共4组，每组3孔，分别换上含0mmol／L、0.25mmol／L、0.5mmol／L、1.0mmol／L PA 及1%FAF BSA 的高糖 DMEN培养24h，收集各组细胞培养液，用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量。每组实验重复3次。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件包进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示，各组间的比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 3T3－L1脂肪细胞油红O染色鉴定 光镜下，3T3－L1前脂肪细胞形态与成纤维细胞相似，呈长梭型，细胞内没有脂肪积聚，油红O染色后细胞不着色。诱导分化后，细胞变圆、变亮，细胞质中逐渐出现大量圆形的脂肪滴。诱导分化8d后，90%以上的细胞呈脂肪细胞表型，胞浆中积聚大量脂滴。油红O染色后，可见细胞质内脂肪滴被染成红色。

2.2 PA对3T3－L1脂肪细胞葡萄糖转运的影响 在100 nmol／L INS的作用下，不同浓度的PA作用于3T3－L1脂肪细胞，0.25mmol／L PA 组、0.5mmol／L PA 组、1.0mmol／L PA组细胞培养液中葡萄糖浓度均显著高于对照组（P＜0.01），0.5 mmol／L PA组较0.25mmol／L PA组显著升高（P＜0.01），1.0 mmol／L PA组较0.5mmol／L PA组显著升高（P＜0.01）。详见 表1。与对照组相比0.25mmol／L PA组、0.5mmol／L PA组、1.0mmol／LPA组葡萄糖摄取率分别下降5.25%、10.29%、14.54%。说明PA具有引起3T3－L1脂肪细胞产生IR的作用，且1.0mmol／L PA作用于3T3－L1脂肪细胞24h抑制细胞葡萄糖摄取的效果最显著。

表1 PA对3T3－L1脂肪细胞葡萄糖转运的影响（±s） mmol／L

表1 PA对3T3－L1脂肪细胞葡萄糖转运的影响（±s） mmol／L

组别 n 培养液葡萄糖浓度对照组3 10.77±0.21 0.25mmol／L PA组 3 12.03±0.271）0.5mmol／L PA 组 3 13.24±0.201）2）1.0mmol／L PA 组 3 14.26±0.231）2）3）与对照组比较，1）P＜0.01；与0.25mmol／L PA组比较，2）P＜0.01；与0.5mmol／L PA组比较，3）P＜0.01

3 讨 论

FFA导致IR的主要机制有：抑制糖代谢中的相关酶，如丙酮酸脱氢酶、磷酸果糖激酶等，抑制糖摄取［7］；长期高FFA可使骨骼肌及脂肪细胞GLUT－4mRNA及蛋白水平减少，并使其转位减少，导致葡萄糖转运障碍［8，9］；在长期高FFA的刺激下，可导致胰岛β细胞凋亡［10］；高FFA可使胰岛素信号通路上IRS－1丝氨酸残基磷酸化增加而酪氨酸磷酸化减少；PI3K活性受抑制，引起葡萄糖转运障碍，导致IR［11］。因此如前所述，FFA在IR发病过程中的作用已成为近年来研究的热点，但用FFA制备体外细胞IR模型的方法未达共识：一方面FFA种类较多，另一方面不同种类制备体外细胞IR模型的浓度还未达成共识。

本研究选用PA制模，摸索其合适的干预浓度。有研究表明，PA 在低浓度（0.2mmol／L、0.3mmol／L）时就可明显抑制3T3－L1成熟脂肪细胞的葡萄糖转运［12，13］，但温宇等［14］报道，PA浓度达到1.0mmol／L时才可明显抑制3T3－L1成熟脂肪细胞胰岛素刺激下葡萄糖的转运。因此，用PA制备IR模型的浓度不确定。在胰岛素刺激下与空白对照组相比，细胞的糖摄取下降，就说明已经产生了IR。本研究结果显示，在100nmol／L INS的作用下，不同浓度的PA作用于3T3－L1成熟的脂肪细胞，与对照组相比各实验组均可抑制葡萄糖的吸收，PA浓度为0.25mmol／L时就可明显抑制3T3－L1脂肪细胞的糖摄取，且随着PA浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。1.0mmol／L PA抑制效果达到了14.54%。说明0.25mmol／L PA作用于3T3－L1脂肪细胞24h就可诱导细胞产生IR，且随着浓度的增加其效果逐渐增强。这为用PA制备3T3－L1脂肪细胞IR模型提供了一种方法和浓度参考。

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