发酵酸菜中嗜热链球菌的分离鉴定与特性研究

王艳萍，栾天奇，郗宏波，李骞，王金菊

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

发酵酸菜中嗜热链球菌的分离鉴定与特性研究

王艳萍，栾天奇，郗宏波，李骞，王金菊

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

从东北自然发酵酸菜中分离筛选得到一株乳酸菌，经形态学鉴定、显色培养基初步鉴定和API鉴定为嗜热链球菌，命名为ST-111，对其进行生理特性及耐酸、耐盐试验的初步研究，该嗜热链球菌在pH 4以下几乎不生长，最适生长pH为7~10，最适盐浓度为0%~3%；在MRS液体培养基中菌株生长较快，2 h即达到对数期，12 h达到稳定期时OD600可以达到4.5左右；该菌株产酸能力较强，培养24 h后发酵液pH可降到3.6以下；耐胆盐试验和胆固醇移除率试验结果表明，该菌株具有较强的胆盐耐受力和较高的胆固醇移除率，在0.1%胆盐条件下生长良好，在0.1%的胆盐条件下的胆固醇移除率为42.3%。

嗜热链球菌；鉴定；胆固醇移除率

Abstract:One strain of Streptococcus was separated and screened from natural fermentation sauerkraut,and identified as Streptococcus thermophilus by morphological identification,color-display medium preliminary appraisal and API test,named ST-111.The growth and fermentation characteristics of this strain were studied in detail.The result indicate that this strain's optimum growth pH value is 7-10,optimum growth salt concentration was 0%-3%.The strain grows well and performs high acid-producing ability in liquid MRS,and achieve the log phase in 2 hours and stable phase in 12 hours while the OD600can reach 4.5 or so;the broth pH can drop below 3.6 after cultured for 24 h.Bile tolerance test and cholesterol removal test indicate that the strain has high bile salt tolerance and cholesterol-removing ability.The strain grows well in the MRS broth containing 0.1%bile salt and the cholesterol-removing rate can reach to 42.3%.

Key words：Streptococcus thermophilus;identification;cholesterol-reducing ability

自然发酵的酸菜中存在大量的乳酸菌，是良好的乳酸菌菌种来源[1]。近年来，乳酸菌由于具有特殊的生理活性和营养功能，日益引起人们的重视。酸菜作为一种传统乳酸菌发酵食品，也越来越受到人们的青睐[2]。深入研究且开发利用东北酸菜资源，对扩大益生菌资源及发现新菌种有着积极的意义。

嗜热链球菌是“公认安全性（GRAS）”的，广泛用于生产一些重要的发酵乳制品，包括酸奶和奶酪（如瑞士干酪、林堡干酪）[3]。研究表明嗜热链球菌可以产生一些具有功能活性的物质，比如胞外多糖、细菌素和维生素等；此外，嗜热链球菌还具有降低胆固醇的功能[4]。血浆中胆固醇水平过高，是引起动脉粥样硬化的危险因子。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症与高胆固醇血症有密切的相关性。国内外大量研究表明，胆固醇代谢的紊乱直接与肠内菌群脱抱合作用的减少和对胆固醇还原能力的下降有关，如乳酸菌的存在与血浆胆固醇的减少有直接关系[5]。本研究从酸菜中分离得到一株具有良好的产酸特性的乳酸菌，对其进行了菌种鉴定及对生物学特性研究胆固醇降解率的研究，为其进一步应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

试验材料：天津市售东北自然发酵酸菜；培养基、生化试剂及染色剂：API试剂盒；MRS培养基、LM 17养基；各种生化试剂和染色液均按文献所介绍的方法配制[6]。

1.1.2 仪器

Eppendorf 5415 D离心机；金钟DY-2型厌氧培养箱；瑞利UV-9100紫外可见分光光度计；METTLER TOLEDO 320 pH计；Nikon YS-100光学显微镜；SANYO超低温冰箱；Yamato SM 510灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离筛选

称取20 g酸菜研磨磨碎，倒入180 mL生理盐水中，然后进行梯度稀释，涂布平板后于37℃厌氧培养48 h，挑取典型菌落进行革兰氏染色并镜检，对获得的一株革兰氏阳性链球菌菌株划线分离纯化2次~3次后进行接触酶反应为阴性，基本确定为乳酸菌[7]，于甘油管中在-80℃冰箱内保存。

1.2.2 分离菌株的生理生化鉴定

将纯化菌株接种到LM 17培养基上厌氧培养24 h进行培养。生理生化鉴定按照法国梅里埃（BioMerieux）公司的产品使用手册，采用API 50 CH试剂盒和API CHL培养基进行49种碳水化合物的发酵试验。菌株依照梅里埃公司的菌种鉴定数据库鉴定。

1.2.3 分离菌株的生理特性研究

1.2.3.1 生长曲线的测定及pH变化

取培养12 h的菌液以2%的接种量接入MRS液体培养基中，37℃培养，每隔2 h取样，用分光光度计测定600 nm处的吸光值，以空白培养基作为对照，测定生长曲线。同时每2 h用pH计测定发酵液pH。

1.2.3.2 菌株对不同初始pH、盐浓度及胆盐浓度的适应性

取对数生长期的菌液以2%的接种量接入初始pH分别为2~10的培养基中，37℃培养24 h，空白培养基作为对照，于600 nm测定OD值。

取对数生长期的菌液以2%的接种量接入添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、18%NaCl的培养基中，37℃培养基24 h，空白培养基作为对照，600 nm测定OD值。

取对数生长期的菌液以2%的接种量接入添加不同质量分数牛胆盐的培养基中，37℃培养24 h，以质量分数为0.4%溴甲酚紫作为指示剂，观察其颜色的变化。

1.2.3.3 体外胆固醇移除率试验

在MRS液体培养基中添加0.1%的胆汁，同时加入按照Razin[8]等提供的方法制备的胆固醇胶束作为胆固醇胶束，即得MRSO-Chol培养基，最终胆固醇含量在0.1 mg/mL~0.3 mg/mL之间。螺口离心试管中加入10 mL上述培养液，按1%的量接入试验菌株，37℃培养 24 h；4℃，12000 r/min离心 10 min，按照 Rrudel和Morris[9]的胆固醇测定方法测定上清液胆固醇含量。以未接种的培养液作为对照，两者之间的差值就是对应菌株降解胆固醇的量。

2 结果与分析

2.1 生理生化鉴定结果

菌株ST-111的菌落形态及显微形态，见图1。

由图1可知，在含有M17的培养基中，菌落呈球形凸起，边缘整齐，直径为0.3 mm~2 mm；显微照片显示菌株为革兰氏阳性链球菌，因此可初步判断该菌为乳酸链球菌。

图2为24 h和48 h的API CHL碳水化合物发酵试验结果，经梅里埃公司的菌种鉴定数据库查询，进一步确定菌株是唾液链球菌嗜热亚种，即嗜热链球菌，将其命名为ST-111。

2.2 生理特性研究

2.2.1 菌株的24 h生长曲线及pH变化曲线的测定

图3为菌液OD值及pH随培养时间变化的曲线图。

由图3可知，菌株生长较快，培养2 h后即进入对数生长期，培养12 h后进入稳定期；同时该菌株产酸速度较快，对数生长期间发酵液中pH下降速度较快，稳定期间pH下降不明显，产酸速度与生长曲线呈正相关，培养24 h后pH可达3.6以下。

2.2.2 菌株对不同初始pH、盐浓度的耐受性

菌株ST-111的生长pH范围，见图4。

如图4所示，菌株在pH 2~4的培养基中几乎不生长。pH 5~7时，培养24 h后，菌浓随pH升高而增加；pH 7~10时，菌浓基本上保持不变，这说明，菌株生长pH范围较大，在pH 7附近长势良好，菌株的最适pH为6~10。不同盐浓度下菌株生长情况，见图5。

如图5所示，菌株具有良好的耐盐性，在盐浓度为6%时仍有一定的生长能力，当盐浓度超过6%时几乎不生长，该菌株的最适盐浓度为0%~3%，由于发酵酸菜盐浓度为2%~4%，因此该菌株适合作为发酵酸菜的发酵剂进行开发。

2.2.3 菌株耐胆盐能力的测定

牛磺胆酸钠为人体胆汁中胆酸盐的主要成分之一，因此选取该盐对菌株的胆酸盐耐受性进行研究，人体小肠中胆汁盐质量分数在0.03%~0.3%之间波动，耐胆盐能力是益生菌的一项重要指标[10]。菌株ST-111的耐胆盐能力，见表1。

表1 菌株ST-111的耐胆盐能力Table 1 Bile tolerance of ST-111

由表1可知，菌株所能生长的最高胆盐质量分数为0.2%，表明该菌株具有良好的耐胆盐能力。

2.2.4 体外降胆固醇试验

2.2.4.1 胆固醇标准曲线

以胆固醇浓度（mg/mL）为纵坐标，吸光度值为横坐标绘制标准曲线，得到邻苯二甲醛法测胆固醇的标准曲线，如图6所示。

2.2.4.2 菌株胆固醇移除率的测定

对照组浓度为0.26 mg/mL，降解后接种ST-111菌株的上清液胆固醇浓度为0.15 mg/mL，降解率达到42.3%，试验结果表明菌株ST-111呈现一定的降胆固醇能力。

3 讨论

本研究从东北酸菜中分离得到一株产酸性状良好的乳酸菌，经初步触媒反应及API鉴定为嗜热链球菌，对其生理特性及体外胆固醇移除率进行了初步研究。在37℃下，菌株生长速度较快，12 h后即进入稳定期，并且该菌株产酸速度较快，培养24 h后pH可达3.6以下，此外，该菌株适应初始pH以及盐浓度的范围较宽，最适生长pH为7~10，最适盐浓度为0%~3%，具有良好的耐酸、耐盐性，具有开发为酸菜发酵剂的潜力。胃肠道生存能力试验结果表明，该菌株能适应较高浓度的胆盐环境（正常人体小肠中浓度为0.03%~0.3%），具有较强的生存能力；降胆固醇试验表明，在含有0.1%胆固醇的MRS培养基中，该菌株的胆固醇移除率为42.3%，具有较高的胆固醇移除率。但是，由于人体小肠环境与体外培养基有很大不同，还需要应用到体内动物模型中去验证，以进一步论证所筛选菌株的降胆固醇性能。文中所筛选的菌株来自于天然发酵酸菜，具有很高的安全性，同时表现了较强的耐酸、耐胆盐活性，因此，该菌株具有一定的应用潜力及市场开发前景。

[1]刘晓辉,陈顺,高晓梅,等.酸菜中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究[J].中国酿造,2009,203(2):62-64

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[4]Ramya Iyer,Tomar S K,T Uma Maheswari,et al.Streptococcus thermophilus strains:Multifunctional lactic acid bacteria[J].International dairy journal,2010,20:133-141

[5]尹军霞,沈国娟,沈蓉,等.酸菜汁中降胆固醇乳酸菌的分离鉴定[J].中国食品学报,2008,8(2):47-51

[6]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999:6-125

[7]金鑫.一株降胆固醇乳酸菌的筛选及其生物学特性的初步研究[D].内蒙古:内蒙古农业大学,2008

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[10]王艳萍,王菁蕊,白小佳,等.一株开菲尔源乳球菌的分离鉴定及特性研究[C]//第十四届中国国际食品添加剂和配料展览会学术论文集,2010:119-123

Study on Isolation,Identification and Characteristics of a Streptococcus thermophilus from Fermentation Sauerkraut

WANG Yan-ping,LUAN Tian-qi,XI Hong-bo,LI Qian,WANG Jin-ju
（College of Food Engineering&Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-12

“十二五”科技部高科技发展研究计划（863计划）（2011AA 100904）

王艳萍(1962—)，女（汉），教授，博士，研究方向：食品生物技术。