木糖母液发酵生产2，3-丁二醇的研究

汪东升，张翠英，彭晓培，周磊，肖冬光

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

木糖母液发酵生产2，3-丁二醇的研究

汪东升，张翠英，彭晓培，周磊，肖冬光*

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

对4株2，3-丁二醇生产菌株利用木糖的能力进行比较，其中肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae CICC 10011）具有最佳的发酵性能，并以该菌为出发菌株对其利用木糖母液发酵2，3-丁二醇进行研究。首先通过单因素试验研究木糖母液和氮源对2，3-丁二醇发酵的影响，然后采用L9（34）正交试验优化发酵培养基的主要成分，优化后的培养基组分为，木糖母液 90g/L，玉米浆 12g/L，K2HPO47g/L，KH2PO42 g/L，（NH4）2SO42 g/L，柠檬酸钠 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·7H2O 0.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L。在优化后的发酵培养基中进行摇瓶发酵，72 h发酵2，3-丁二醇浓度为35.7 g/L，比优化前增加了7.5 g/L，2，3-丁二醇得率达到了理论得率的92%。

菌种筛选；木糖母液；2，3－丁二醇；培养基优化

Abstract:Four 2,3-butanediol producing strains were compared to utilize xylose,in which Klebsiella pneumoniae CICC 10011 was the best,with which as the starting strain xylose mother liquor was used to produce 2,3-butanediol.Firstly,single-factor experiments were carried out to study the effects of xylose mother liquor and nitrogen source.The fermentation medium was then optimized by orthogonal design.The optimized composition was as follows:xylose mother liquor 90 g/L，CSLP 12 g/L，K2HPO47 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO42 g/L,sodium citrate 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,MnSO4·7H2O 0.005 g/L,ZnSO4·7H2O 0.01 g/L.Under above conditions,final concentration of 2,3-butanediol reached 35.7 g/L,7.5 g/L higher than that under the initial conditions,the yield was 92%of the theory.

Key words：strain screening;xylose mother liquor;2,3-butanediol;medium optimization

2，3-丁二醇是一种无色无味的手性化合物，存在3 种旋光异构体，分别为 D－（－）－2，3-丁二醇，L－（＋）-2，3-丁二醇和 meso-2，3-丁二醇[1-2]。作为一种大宗化学品，广泛应用于化工、食品、医药、燃料以及航空航天等多个领域。目前，利用微生物发酵生产2，3-丁二醇已经获得广泛的研究，其常见原料为淀粉水解液、糖蜜、乳清等[3-4]，成本较高。其中木质纤维原料含糖量丰富，来源广泛，成本较低，经过化学和生物的处理可以用以生产2，3-丁二醇。玉米芯作为一种木质纤维素原料，在我国有广泛的来源。木糖母液是以玉米芯为原料生产木糖醇工业中的副产物，混合糖含量高，主要成分是木糖，还有少量的阿拉伯糖和葡萄糖[5]。目前利用木糖母液生产2，3-丁二醇的研究还处于起步阶段，鲜见有关利用木糖母液生产2，3-丁二醇的报道。本文比较4株常见的2，3-丁二醇生产菌利用木糖生产2，3-丁二醇的能力，筛选出适合木糖母液发酵的菌种，并对其发酵培养基进行了优化，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae CICC10011），产酸克雷伯氏菌（KlebsiellaoxytocaCICC21518），产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca CICC 22913），多黏芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa CICC 10010）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

斜面培养基（g/L）：葡萄糖 20；蛋白胨 10；酵母粉5；氯化钠 10；琼脂 2。种子培养基（g/L）：木糖 20；蛋白胨10；酵母粉5；氯化钠10。初始发酵培养基（g/L）：木糖 80，酵母粉 20，K2HPO45，KH2PO42，（NH4）2SO42，柠檬酸钠 3，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4·7H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.01。优化后发酵培养基（g/L）：木糖母液 90，玉米浆 12，K2HPO47，KH2PO42，（NH4）2SO42，柠檬酸钠3，微量元素浓度与初始发酵培养基相同。

培养基一律115℃灭菌20 min，发酵培养基中木糖和木糖母液单灭。

1.2 方法

1.2.1 种子培养

接一环生长良好的斜面菌接入装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，置于转速为200 r/min的摇床上，37℃培养12 h。

1.2.2 发酵培养

按体积比5%的接种量将种子液接种到装液量为100 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，初始pH 6.0，置于35℃恒温摇床上发酵，摇床转速120 r/min，发酵时间72 h。

1.2.3 分析方法

总糖浓度的测定：DNS法[6]。

木糖、葡萄糖、阿拉伯糖浓度的测定：高效液相色谱法。色谱条件为：色谱柱型号Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad美国），柱温65℃，流动相0.005 mol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min。示差检测器检测，进样量20 μL。

2，3-丁二醇浓度的测定：见文献[7]。

2 结果与讨论

2.1 出发菌株的选择

一般来说，肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和多粘芽孢杆菌都是发酵生产2，3-丁二醇的常见菌种[8-9]。从上述菌种中挑选了4株菌种，以初始发酵培养基为基础，考察4株菌利用木糖发酵生产2，3-丁二醇的情况，结果见表1。

由表1的结果可知，4株菌利用木糖的能力各有不同，2株产酸克雷伯氏菌利用木糖母液生产2，3-丁二醇的能力都较差，2，3-丁二醇浓度和得率都不高；多黏芽孢杆菌利用木糖的能力最差，2，3-丁二醇浓度只有12.7g/L；肺炎克雷伯氏菌CICC10011利用木糖的能力最好，最终2，3-丁二醇浓度和得率分别为28.2g/L、0.39 g/g，糖利用率达到90.0%，因此选定肺炎克雷伯氏菌CICC10011为利用木糖母液发酵生产2，3-丁二醇的出发菌株。

表1 4种不同菌株利用木糖的发酵结果Table 1 Fermentation results of 4 different strains using xylose

2.2 木糖母液浓度对2，3-丁二醇发酵的影响

木糖母液中主要成分是木糖，还含有少量的葡萄糖和阿拉伯糖。一般来说较高的糖浓度对菌种发酵有抑制作用，从工厂直接得到的木糖母液，其混合糖浓度大约为600 g/L，其中木糖浓度400 g/L，葡萄糖和阿拉伯糖浓度大致相等为65 g/L，不适合直接进行发酵利用。根据相关文献报道[10-11]，选定初始木糖母液浓度分别为 60、80、100、120 g/L，发酵不同时间，考察木糖母液浓度对发酵的影响，结果见表2。

表2 木糖母液浓度对发酵的影响Table 2 Effect of xylose mother liquor on the production of 2，3-butanediol

从表2可以看出，当初始木糖母液浓度为60g/L时，木糖利用率是最高的，达到92.7%，可其2，3-丁二醇得率较低为0.36，说明底物浓度较低时有利于底物的利用，但其经济效益不高。木糖母液浓度浓度为80 g/L时，2，3-丁二醇得率最高为0.39，当木糖母液浓度超过100 g/L时，2，3-丁二醇浓度虽然还在升高，但木糖母液利用率和2，3-丁二醇得率开始下降，说明底物浓度太高会抑制2，3-丁二醇的发酵，因此选择初始木糖母液浓度为80 g/L。

2.3 氮源对2，3-丁二醇发酵的影响

2.3.1 不同氮源对2，3-丁二醇发酵的影响

初始发酵培养基中氮源为酵母粉，酵母粉是常用的氮源和生长因子的来源。可是酵母粉价格昂贵，并不适合工业生产，因而需要选择一种既高效又低廉的氮源来代替酵母粉。控制初始氮源浓度为20 g/L，分别以酵母粉、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素、氯化铵为氮源，考察不同氮源对木糖母液利用和2，3-丁二醇生成的影响，结果如图1所示。

由图1可知，玉米浆、蛋白胨、酵母粉作为氮源时，木糖利用率和2，3-丁二醇得率都明显优于无机氮源，其可能的原因是有机氮源营养成分较多，含有能促进微生物生长的维生素、氨基酸和微量元素等。当以玉米浆和蛋白胨作为氮源时，木糖利用率和2，3-丁二醇得率要高于酵母粉，说明玉米浆和蛋白胨更利于2，3-丁二醇的发酵，玉米浆比蛋白胨成本更低，因此选择玉米浆为最适合的氮源。

2.3.2 玉米浆浓度对2，3-丁二醇发酵的影响

玉米浆是玉米湿法研磨的主要副产物，含氮量超过了40%，其中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，其广泛用于发酵工业。本试验在木糖母液浓度为80 g/L时，考察不同玉米浆浓度对2，3-丁二醇发酵的影响，结果见表3。

表3 玉米浆对2，3-丁二醇发酵的影响Table 3 Effect of corn liquor on the production of 2，3-butanediol

由表3结果可知，随着玉米浆浓度的增加，残糖浓度在降低，木糖母液利用率增加，可见随着氮源浓度的增加糖的利用也在加快。2，3-丁二醇产量也随着玉米浆浓度的变化呈现先增加后降低的趋势，当玉米浆浓度为12 g/L时，2，3-丁二醇浓度和得率达到最大，分别为32.1 g/L和0.43 g/g。玉米浆浓度超过12 g/L后，木糖母液利用率继续升高，2，3-丁二醇浓度却开始下降，可能的原因是氮源浓度过导致菌种以生产生物量增多，代谢产物2，3-丁二醇的生成减弱，因此选择12 g/L为玉米浆的最适浓度。

2.4 正交试验优化发酵培养基

发酵培养基中磷酸氢二钾和柠檬酸钠对2，3-丁二醇发酵也有重要的影响，Ma等[8]通过Plackett-Burman设计确定了玉米浆和磷酸氢二铵为显著因素。李元芳等[9]发现在培养基中添加柠檬酸不仅促进细胞生长与糖消耗速度，还可以缩短发酵周期，提高2，3-丁二醇产量。因此我们在前面单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，考察木糖母液、玉米浆、磷酸氢二钾和柠檬酸钠这4种因素对发酵影响的显著程度，正交因素水平表见表4。

表4 正交试验因素水平表Table 4 The levels of factors table of orthogonal experiment

正交试验结果和各因素效应图如表5和图2所示，各因素对发酵影响的大小顺序为木糖母液＞玉米浆＞磷酸氢二钾＞柠檬酸钠，最终确定的发酵培养基组成为：木糖母液90g/L，玉米浆12g/L，磷酸氢二钾7g/L，柠檬酸钠3 g/L。

表5 正交试验结果及极差分析Table 5 Results and analysis of range of orthogonal experiment

2.5 最优培养基验证

按照优化后的发酵培养基组成发酵生产2，3-丁二醇，共进行3组平行，发酵72 h，2，3-丁二醇浓度达到了35.7 g/L，比优化前增加了7.5 g/L，木糖母液利用率为87%，2，3-丁二醇得率为0.46 g/g。

3 结论

本实验中4株2，3-丁二醇生产菌株都具有利用木糖的能力，但是性能各异，其中Klebsiella pneumoniae CICC 10011是最优的发酵菌株，以木糖母液为底物通过单因素试验和正交设计优化了发酵培养基，以优化后的发酵培养基发酵，2，3-丁二醇浓度达到了35.7 g/L，2，3-丁二醇得率为理论得率的92%。

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2,3-Butanediol Production Using Xylose Mother Liquor

WANG Dong-sheng,ZHANG Cui-ying,PENG Xiao-pei,ZHOU Lei,XIAO Dong-guang*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-07

汪东升（1987—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：现代酿造技术。

*通信作者：肖冬光，教授。