西维因抗体库的构建及特异性克隆的筛选

王硕，刘昕煜，吴懿娜，杜欣军，朱超，张洁

（食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

西维因抗体库的构建及特异性克隆的筛选

王硕，刘昕煜，吴懿娜，杜欣军，朱超，张洁

（食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

在计算机辅助下，设计并合成西维因半抗原，与载体蛋白KLH连接后免疫Balb/C小鼠，经过5次免疫后，最高效价和特异性抑制率分别达到254000和26%；提取免疫后小鼠脾脏总RNA，纯化mRNA后反转录获得cDNA，利用设计的兼并引物获得长度约为400 bp的轻链可变区和重链可变区基因片段，重叠延伸后获得长度约为780 bp的单链抗体基因。经过EcoR I和HindⅢ酶切后，连入T7噬菌体臂，构建西维因特异性的抗体库，抗体库原始滴度为1.74×107pfu。以西维因-OVA为配体对抗体库进行淘选，经过4轮淘选后，利用直接ELISA对获得噬菌体克隆进行特异性检测，西维因对克隆A4-7和A4-16的抑制率分别达到54.1%和66.4%。经过序列测定，2个克隆的轻链可变区分别由108和112个氨基酸构成，重链可变区分别由117和112个氨基酸构成。

西维因；噬菌体展示；重组抗体

Abstract:Carbaryl hapten,which was designed using computer softwares and synthesized by chemical synthesized methods,was connected with carrier protein KLH.Then Balb/C mice were immunized using the connected product as the immunogen.After 5 rounds of immunization,the highest titer and the specific inhibition rate of the immune serum reached 254000 and 26%respectively.Total RNA was extracted from the immunized mice spleen and mRNA was purified.The cDNA was obtained by reverse transcription and used as template for PCR amplification of variable regions of antibodies.The variable regions of light chain (VL)and heavy chain(VH)were about 400 bp in length.Then the single-chain antibody gene(scFv)about 780 bp was obtained with overlap PCR method.The scFv fragments were digested by restriction enzyme EcoR I and Hind III.The digestion production was ligated into T7 phage arms and the carbaryl-specific phage-displaying antibodylibrarywasconstructed.Afterexaminationoriginaltiteroftheprimaryphagelibraryreached1.74×107pfu.The antibody library was panning using carbaryl-OVA as the coating ligand.After 4 rounds of panning,affinities and specificities of the individual colonies were detected with direct ELISA and the inhibition rates of free carbaryl against clone A4-7 and A4-16 reached 54.1%and 66.4%respectively.Sequencing results indicated that the light chain variable regions of the 2 clones comprised 108 and 112 amino acids respectively.The heavy chain variable regions of the 2 clones comprised 117 and 112 amino acids respectively.

Key words：carbaryl;phage display;recombinant antibody

化学农药在防治有害生物和提高农业经济效益方面发挥了重大作用[1]，成为提高农业产量的重要措施之一[2]。但在农药的生产与使用过程中不仅会对土壤、大气、水资源等造成污染，而且农药的残留毒性会对环境生物及人体健康造成严重的危害。

西维因（Carbaryl），又名胺甲萘[3]，是世界上最早商品化的一种氨基甲酸酯类农药，它对昆虫具有触杀和胃毒作用，广泛应用于农作物的害虫防治[4]。西维因常用的检测方法包括气相色谱、高效液相色谱以及色谱与质谱联用等技术[5]。但是，这些检测方法的样品前处理技术复杂、耗时、耗力，必须有专业人员在专门的实验室操作，大大影响了实时性，导致市场监测的滞后。免疫分析作为一种较为先进的小分子物质检测方法[6]，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，被广泛应用于农药残留的检测。免疫分析法的分析时间短，检测成本低，便于检测人员现场操作[7]，但在抗体制备过程中小分子农药的半抗原不易合成、抗体获得的周期较长、动物的选择要求较高，且由于动物个体差异导致批次间稳定性差，不易于大量制备，这些缺点大大限制了其应用的范围。而基因工程抗体作为一种先进形式的抗体[8]，具有分子量小、氨基酸组成清楚、便于基因改造、可大量制备、相对成本较低等优势，在很大程度上弥补了传统抗体的缺陷。随着技术的不断进步，基因工程抗体必定将在小分子有害物质检测中发挥越来越重要的作用。

本研究构建了西维因特异性抗体库，并从中筛选到2个亲和性和特异性较为理想的克隆，为西维因基因工程抗体的制备与应用提供了良好的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

雌性、六周龄Balb/c小鼠：购于北京军医大学；大肠杆菌DH5α为本实验室保存。

总RNA提取试剂盒：Qigen公司；mRNA纯化试剂盒、Pfu DNA polymerase、EcoRI限制性内切酶、Hind III限制性内切酶、T4 DNA连接酶：Promega公司；反转录试剂盒：上海生工生物技术有限公司；T7 select 10-3 cloning kit：Novagen 公司；西维因标品：Chem Service公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清蛋白、羊抗鼠酶标二抗：Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 半抗原的合成[7]

将萘酚溶于二氯甲烷与吡啶形成混合溶液，逐滴加入溶有对硝基苯氯甲酸酯的二氯甲烷，冰浴搅拌反应5 h。反应体系用3%的盐酸振荡洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，得到淡黄色的1-萘氧基-4-硝基苯碳酸酯晶体。溶解于pH为8.2的氢氧化钠溶液的6-氨基己酸中逐滴加入溶有制得的1-萘氧基-4-硝基苯碳酸酯，冰浴下边滴边搅拌，反应过夜。盐酸酸化，干燥后柱层析纯化，收集目标组分，即为西维因的免疫原5H-KLH。

1.2.2 小鼠的免疫

使用西维因免疫原，腹腔常规免疫6周龄Balb/C雌性小鼠。每次的免疫剂量为200 μg/只，每两周免疫一次。使用间接Elisa法测定免疫后小鼠抗血清效价及特异性。

1.3 抗体库构建

1.3.1 引物设计与合成

根据小鼠抗体基因的轻链可变区和重链可变区基因序列及参考文献，设计合成26条轻链兼并引物和29条重链兼并引物[9-10]，并由上海生工公司合成。

1.3.2 小鼠脾脏mRNA提取及cDNA合成

选择效价和特异性较高的小鼠摘取脾脏，用Qigen的总RNA提取试剂盒提取小鼠脾脏总RNA，洗脱的RNA用1%琼脂糖凝胶成像检测，冻存于-80℃备用。将所提取的小鼠脾脏总RNA按所测OD值定量后，等比例混合后用磁珠分离纯化mRNA。紫外分光光度计分析mRNA纯度与浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测mRNA质量后，取1 mg mRNA合成第一链cDNA。

1.3.3 轻链可变区和重链可变区基因扩增

分别将轻链可变区、重链可变区的上下游引物等摩尔数混合，以cDNA为模板扩增轻链可变区和重链可变区，轻链扩增程序为：95℃2 min；95℃1 min，53℃1 min，72℃1min，循环 35 次；72℃10min。重链扩增程序为：95 ℃ 2 min；95℃ 1 min，58℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次；72℃10 min。

1.3.4 重叠延伸PCR

分别取纯化后的轻链、重链可变区各取50 ng，进行无引物重叠延伸，程序如下：94℃1 min，63℃1 min，68℃1 min，循环20次。循环结束后，向反应体系中加入等体积除模板外的PCR反应成分，所用引物为接头引物，反应程序为：94℃1 min，53℃1 min，72℃1 min，循环30次。电泳检测后胶回收单链抗体基因。

1.3.5 抗体库的构建与滴度的测定

利用EcoRⅠ和Hind III对得到的scfv纯化后进行双酶切，胶回收后进行浓度测定，取0.06 pmol scFv与T7 select10-3b载体臂于16℃连接16 h，将连接产物与T7包装提取物于22℃温育2 h进行体外包装，加入270 μL LB培养基终止反应，即构建完成西维因原始抗体库。按照T7试剂盒操作说明对原始抗体库滴度进行测定，液体扩增后对扩增后抗体库进行滴度测定。

1.4 特异性噬菌体克隆的淘选

1.4.1 包被原的合成[7]

半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）一起加入无水四氢呋喃中，在氮气保护下逐滴加入溶有N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）的无水四氢呋喃溶液，室温下搅拌反应4 h，将反应体系置于-20℃冰箱内，过滤除去白色沉淀，离心得到白色针状半抗原活化酯。

将载体蛋白溶于KH2PO4溶液中，同时将上述半抗原酯化物，溶解于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中逐滴加入至蛋白溶液中，4℃旋转过夜后将反应液装入透析袋，4℃条件下在PBS中缓冲溶液中透析3 d，将透析液冷冻干燥后得到白色粉末，贮于-20℃下备用。

1.4.2 淘选

用无菌水清洗酶标板，每次200 μL，共洗涤5次；每孔加入100 μL浓度为10 μg/mL的西维因包被原，4℃过夜；200 μL/孔TBS洗涤3次；分别使用 5%BSA，5%脱脂奶粉和10%脱脂奶粉37℃封闭1h；200μL/孔TBS洗涤5次，加入用TBST稀释为1010pfu/mL的扩增后噬菌体100 μL/孔，室温放置30 min后4℃过夜；200 μL/孔 PBST 洗涤 20 次，200 μL/孔 TBS 洗 10 次；用200 μL/孔1%SDS洗脱特异性结合的噬菌体；检测洗脱噬菌体滴度，扩增后进行下一轮淘选。2轮~4轮淘选包被原用量分别为 0.5、0.1、0.02 μg/孔。

1.5 噬菌体克隆的扩增及活性检测

经过4轮淘选，挑取边界清晰的单克隆噬菌斑，放入50 μL提取缓冲液中，在4℃条件下静置12 h。以浸取液为模板，利用噬菌体载体引物对淘选的噬菌体克隆进行PCR验证，PCR条件为：95℃ 1 min；95℃1 min，50℃1 min，72℃2 min，循环35次，72℃10 min。

选择阳性噬菌体克隆进行液体扩增与滴度测定。利用直接竞争ELSIA检测阳性克隆的亲和力和特异性：在96孔板中包被109pfu/孔阳性克隆噬菌体，4℃过夜；5%BSA封闭1 h后，分别向同一克隆的平行孔中加入HRP标记西维因、HRP标记西维因和1 mg/L的西维因农药标品，1 h后加入底物显色。

2 结果

2.1 抗血清效价与特异性

经过5次腹腔注射免疫后，4只小鼠效价分别为0、184000、254000、55000，标品浓度 5 mg/L 时抑制率分别为0%、12%、26%和8%，选取特异性较高的第3只小鼠提取脾脏总RNA。

2.2 西维因免疫小鼠脾脏总RNA的提取及mRNA的纯化

通过电泳检测，总RNA纯度较好，其28 S rRNA为18 S rRNA亮度的2倍，表明总RNA完整性较好（图1 A），电泳检测mRNA主要在500 bp以上成弥散状，表明mRNA完整性较好（图1 B）。

2.3 scFv扩增

利用抗体可变区的兼并引物，PCR扩增出长度约为440 bp的轻链可变区片段（图2 A）和450 bp的VH（图2 B）。根据紫外分光度计算VL和VH浓度分别为15 ng/μL和3 ng/μL，加入等量的轻链重链进行重叠延伸PCR扩增scFv，电泳检测其长度约为780 bp（图3），与预期结果相符。

2.4 抗体库滴度测定与扩增

经过EcoR I和HindⅢ酶切后，将scFv与T7噬菌体臂连接，包装后构建形成抗体库，经过检测，原始文库的库容为1.74×107pfu，液体扩增后滴度为3×1011pfu/mL。

2.5 抗体库的淘选

以包被原西维因-OVA作为筛选配体，分别使用5%BSA、5%脱脂奶粉和10%脱脂奶粉作为封闭液对文库进行淘选，经过4轮淘选后，3种封闭液获得噬菌体富集量见图4。

2.6 淘选后噬菌体的克隆的PCR验证

经过4轮淘选随机挑选单克隆噬菌斑，用Extraction Buffer提取噬菌体，进行PCR验证，共获得含有完整scFv片段的克隆14个。

2.7 噬菌体克隆的ELISA检测

直接竞争ELISA对14个阳性克隆进行特异性检测，其中A4-7和A4-16特异性较好，抑制率分别达到54.1%和66.4%。

2.8 西维因单链抗体的测序

对特异性较好的2个噬菌体克隆进行测序，其中克隆A4-7的轻链可变区由108个氨基酸构成，重链可变区由117个氨基酸构成。克隆A4-16的轻链可变区由112个氨基酸构成，重链可变区由112个氨基酸构成（图6）。

3 讨论

近年来对噬菌体抗体库的研究,意在将其应用于安全检测及医疗制药等领域[11]。但目前所获得的噬菌体抗体亲和力较低，因此科研工作者一直努力地通过提高噬菌体抗体库的库容和多样性、优化淘选方法及淘选所用抗原等途径，来获得亲和力高的噬菌体抗体[12]。

抗体种类的丰富性和单链抗体基因开放阅读框的正确性是决定抗体库质量的两个关键因素。本实验设计合成26条轻链兼并引物和29条重链兼并引物，得到的序列可以反映出免疫过程中抗体分子的多样性，为构建高丰富度抗体库奠定良好的基础。利用重叠延伸方法克隆单链抗体基因的最大问题是易发生移码突变，导致抗体库大量克隆不能够正确展示抗体可变区，从而大大降低抗体库的实效性，本实验使用了高保真的pfu DNA聚合酶对片段进行重叠延伸连接，并且对于扩增条件进行了系列优化，以减少移码错配现象发生。

得到库容较高的噬菌体抗体库后，高效率的筛选过程是活的特异性噬菌体克隆的关键，而筛选效率在很大程度上取决于人工抗原的制备。目前合成的人工抗原普遍存谱宽足够但特异性不高或者谱宽较窄但是特异性较高的情况[13]，真正达到两种结果一致的情况较少，成为了开发检测试剂盒的主要制约因素。本实验结合计算机模拟，设计检测分子共性结构的人工抗原，有针对的设计出合理的抗原结构，通过比较其谱宽和特异性，选择较好的样品用于后续试验，保障了抗体库的特异性和筛选的效率。T7噬菌体抗体库的应用为人工抗体的制备提供了一种新的途径，将对农药残留免疫检测的发展起到重要的推动作用。

4 结论

本试验成功构建了西维因特异性抗体库，库容为1.74×107pfu。经过淘选和ELISA验证，从中筛选到2个亲和性和特异性较为理想的克隆，游离西维因对2个噬菌体克隆的抑制率分别达到54.1%和66.4%。经过序列测定，2个克隆的轻链可变区分别由108和112个氨基酸构成，重链可变区分别由117和112个氨基酸构成。本研究为西维因基因工程抗体的制备与应用提供了良好的参考。

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Construction of Phage ScFv Library Against Carbaryl and Selection of Specific Phage Clones

WANG Shuo,LIU Xin-yu,WU Yi-na,DU Xin-jun,ZHU Chao,ZHANG Jie
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-19

国家自然科学基金项目（20905058，31071547）

王硕（1969—），男（汉），教授，博士，主要从事食品安全研究。