乳源性ACE抑制肽和抗氧化肽结构与生理活性关系的研究

潘忠星，冯志彪

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学理学院应用化学系，黑龙江哈尔滨150030）

乳源性ACE抑制肽和抗氧化肽结构与生理活性关系的研究

潘忠星1，冯志彪2，*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学理学院应用化学系，黑龙江哈尔滨150030）

乳蛋白中的血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽和抗氧化肽的一级结构会对它们的活性产生重要的影响。文章综述了肽段的氨基酸组成、种类、疏水性氨基酸含量、存在位置等对其活性的影响，并总结了近几年鉴别出的新的活性肽段。由于多肽的结构和组成对其生理活性产生明显的影响，因此对其结构和活性之间的关系的研究，将会对今后获得更高活性的生理活性肽提供帮助。

乳蛋白，生物活性肽，一级结构，生理活性

Abstract：Primary structure of milk-derived antihypertension peptides and antioxidative peptides have some important effect on their function.The composition of peptides，types，the content of hydrophobic amino acids and their position how to affect on their activity，were reviewed，and the novel bioactive peptides identificated in recent years was also summarized.Bioactivities was significantly influenced by the structure and composition of peptides，therefore，the study on primary structure-bioactive relationship of milk-derived bioactive peptides would provide information for obtaining efficient bioactive peptides in the future.

Key words：milk protein；bioactive peptides；primary structure；bioactivities

乳蛋白水解后能产生大量的生物活性肽，在体内发挥各种调节功能和生理功能，如清除体内过量的自由基、降低血压、抗菌、免疫调节功能、阿片样活性、降血脂、抗血栓活性等[1-3]，Hernández-Ledesma等人对此已有评述[4]。因此，对生物活性肽结构与其活性关系的研究至关重要。生物活性肽是指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称。生物活性肽大部分以非活性状态存在于蛋白质长链中，当被蛋白酶酶解成适当的长度时，才会表现出某种生理活性。肽段的生理活性受到本身的氨基酸组成、结构和肽链的长度的影响，活性序列的长度大约在2～20个氨基酸左右。Ferranti等也发现只有中等和低分子量的肽段才具有较高的生理活性[5]。而且，研究发现有些特殊的肽序列具有多种生理活性，如Srinivas等[6]和Hernández-Ledesma等[7-8]分别从αS2-casein和β-乳球蛋白中鉴别出同时具有抗氧化和ACE抑制活性的肽段。目前，一些研究者通过各种分析方法建立肽段的组成和生理活性的关系。Peña-Ramos引用多种分析方法（相关分析、主元件分析、多次回归、判别式分析）建立了氨基酸组成对抗氧化活性的影响的模型[9]。Ferreira等建立了ACE抑制肽的产量和水解时间的相关曲线[10]，这为以后研究肽段的生理活性提供了更简便的方法。本文讨论乳蛋白肽段的一级结构对其ACE抑制活性及抗氧化活性的影响，总结了近年来鉴别出的一些活性肽段的组成特点，进而总结活性肽的氨基酸组成、种类、疏水性氨基酸含量、存在位置等对其活性的影响，为今后更好的开发和利用生物活性肽提供理论支持。

1 生物活性肽制备方法

生物活性肽的产生方式有多种，主要有动植物组织器官提取法、化学合成法、蛋白酶水解法、基因工程法和微生物发酵法，而蛋白酶水解法是产生生物活性肽的最普遍的方式。

不同蛋白酶有不同的专一性和不同的酶切位点，使得到的产物多肽的N末端和C末端氨基酸组成及氨基酸排列位置各异，因此根据原料蛋白的氨基酸组成特点选择合适的蛋白酶，并由水解度大小控制肽段的相对分子质量，就有可能得到具有高生理活性的多肽。Otte等人用5种酶对9种乳蛋白进行水解，结果发现用嗜热蛋白酶对酪蛋白和乳清蛋白水解均能得到活性较高的ACE抑制肽，而在9种乳蛋白中，α-乳白蛋白是活性相对最高的蛋白[11]。Srinivas等用氨基肽酶、羧基肽酶、细菌蛋白酶、真菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶5种不同的酶水解牛乳α-Casein，得出由胰凝乳蛋白酶水解的活性最高的结论[12]。同样Hernandez-Ledesma等人用胃蛋白酶和胰酶水解人乳和婴儿配方奶粉，从水解物中鉴定出具有高ACE抑制活性和抗氧化活性的肽段[8]。Ferreia用胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的是具有高ACE抑制活性的水解物[10]。

2 乳蛋白ACE抑制肽

Maruyama在1982年首次报道了牛乳酪蛋白的酶水解物中存在能够抑制ACE活性的肽类物质之后[13]，人们对乳蛋白ACE抑制肽结构与生理活性之间关系的研究越来越多。乳蛋白抑制肽以其高活性、无毒、无副作用、安全可靠等特点，在体内降血压方面表现出广阔的应用前景。

2.1 ACE抑制肽的组成及特点

ACE抑制肽的活性与他们的一级结构密切相关，有很多研究鉴定出来自于乳蛋白ACE抑制肽的氨基酸序列[3]。尽管具体的ACE抑制肽的结构与活性的关系还不是很明确，但已经发现了一些普遍存在的特点。

乳蛋白水解后得到肽段的长度各不相同，链的长短与ACE抑制活性没有一定的线性关系。ACE抑制肽的长度一般多为2～12个氨基酸，也有个别的含27个氨基酸以上的肽段[14]。Miguel用胃蛋白酶水解牛乳酪蛋白制备ACE抑制肽，结果分子量小于3000u的肽段ACE抑制活性较高，证明主要是小肽发挥活性作用[15]。

ACE抑制肽必须与ACE活性部位紧密的结合，才能表现出对ACE的抑制活性。ACE酶的C端区域的催化部位由三个亚基组成，能容纳血管紧张素Ⅰ的C端的三个疏水性氨基酸：Pro、His和Phe，从而催化血管紧张素Ⅰ转化为血管舒缓激肽，使血压升高。因此，活性肽段的C末端三肽序列强烈影响肽段与ACE酶结合的程度，从而影响ACE酶活性的发挥[5]。

2.2 ACE抑制肽一级结构与活性的关系

2.2.1 C端的疏水性氨基酸与活性的关系 ACE抑制肽结构-活性的关系表明，C端氨基酸的疏水性和ACE抑制活性之间正相关[11，16]。表1列出了乳蛋白ACE抑制肽的C端三肽位置的疏水性氨基酸的质量分数和活性的关系。

由表1可以看出，乳蛋白ACE抑制肽的一级结构中含有大量的疏水性氨基酸，特别是C端三肽的位置，其疏水性氨基酸的含量和活性关系表明，除个别肽段外，绝大多数降压效果符合上述规律的。

如表1所示，Otte等从β-酪蛋白A2中鉴定出的活性肽段含有相同的C端三肽序列-IPP，C末端三肽含有三个疏水性氨基酸而且Pro在C末端位置，IC50值达到4～5μmol/L，具有很高的ACE抑制活性，同时鉴别出的肽段f（59-81）C端含有-QTP与前边两个肽段相比ACE抑制活性较低[21]。

很多资料明确的表明，在C末端，疏水性氨基酸Leu的存在能显著提高ACE抑制活性。Tavares从β-酪蛋白鉴别出的肽段RELEEL（f1-6）和α-乳白蛋白RELKDL（f10-15）均具有较高的ACE抑制活性[22]。Gómez-Ruiz从αs1-酪蛋白鉴别出的肽段VPSERYL（IC50249.5μmol/L）活性明显高于肽段VPSERY（IC50706.1μmol/L），而且作者为了证明Leu对活性的影响新合成了肽段VRYG和KKYNNPQG，结果与鉴别出的活性肽段VRYL和KKYNNPQL相比，ACE抑制活性较低。所以疏水性氨基酸会对活性产生一定的影响，但是疏水性氨基酸不能单独决定活性的强弱，还受到其他因素的影响，特别是Pro的存在位置的影响。

2.2.2 C端Pro的存在位置的影响 大量的文献表明，ACE一级结构中Pro的存在位置及分布决定其活性的强弱。一般情况下Pro存在于C末端及三肽的位置时，肽段具有很高的ACE抑制活性[23]。如表2所示，大部分Pro存在于C末端及三肽的位置其IC50较低，活性较高，符合上述规律。

表1 乳蛋白C-端三肽位置疏水性氨基酸质量分数与活性的关系Table 1 Relationship between percentage of the hydrophobic amino acids in C-terminal tripeptide positions of milk protein and its bioactivity

Quiros等为了研究C端三肽位置的氨基酸对ACE抑制活性的影响，使用从β-酪蛋白水解物鉴定出的肽段f（124-129）LHLPLP，用不同的氨基酸来代替C末端三肽位置的氨基酸合成新肽，从表3可以看出，LHLPLP比LHLWLP及LHLYLP有相对较低的IC50值，说明Pro存在于C端三肽的位置能显著提高肽段的活性。Otte等从α-乳白蛋白水解物中鉴别出的活性肽段含有相同的C端三肽序列-PEW，与以上规律一致且末端含有疏水性氨基酸Trp，IC50值低至1～5μmol/L之间，具有很强的活性。

表2 乳源蛋白ACE抑制肽一级结构中的脯氨酸的存在位置与活性的关系Table 2 Relationship between where the proline located in the primary structure of milk protein antihypertension peptides and its bioactivity

表3 对LHLPLP肽段修饰后合成肽段的ACE抑制活性[23]Table 3 ACE-inhibitory activity of synthetic peptides corresponded to modifications of LHLPLP[23]

2.2.3 C端带正电荷的氨基酸与活性的关系 有关肽段结构和ACE抑制活性的资料表明C末端存在赖氨酸（ε-氨基正电荷）和精氨酸（胍基正电荷）能提高肽段的ACE抑制活性[10]。从表3中肽段LHLPLR可以看出，C-末端精氨酸的存在与其他肽段相比，其ACE抑制活性较强[23]。表1中肽段f（142-148）（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）同样具有较高的活性[21]。

2.2.4 N端氨基酸与活性的关系 乳蛋白ACE抑制肽的N端具有芳香环氨基酸和碱性氨基酸时，能提高活性。由表1和表2也可以看出，绝大多数N端为碱性和芳香环的氨基酸抗高血压效果较好。同时也有报道指出，N-端为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等氨基酸残基的肽段时，其降血压效果较显著，但N端为脯氨酸时其活性反而降低[25]。但是随着乳蛋白ACE抑制肽的不断研究发现，其结构存在的差异也越来越多，有数据显示ACE活性与肽段的N端结构没有相关性[23，26]。因此这类关系还没有完全的明确。

乳蛋白ACE抑制肽的结构与活性的关系主要是由一级结构中疏水性氨基酸、脯氨酸、C-端带正电荷的氨基端以及N-端氨基酸的存在状况综合作用的结果。

3 乳蛋白抗氧化肽

Marcuse首次报到了在蛋白质氨基酸序列中存在抗氧化性质后，人们对肽段的抗氧化性质的研究越来越关注。一些生物活性肽具有高效的抗氧化活性，比天然抗氧化剂更安全、更稳定和更高效，而且乳蛋白是重要的抗氧化肽的来源。它具有极好的抗氧化作用是因为它能够抑制脂类氧化，途径主要有以下几个方面：使活性氧失活清除自由基、螯合金属离子、减少氢过氧化物的形成以及改变食品体系的物理性状等[27]。

国内外关于抗氧化肽结构与活性的关系研究的文献报道不多，仅对两种天然抗氧化肽谷胱甘肽和肌肽做了较多的研究，确定这两种肽的分子结构且进行了相关机理的研究。目前，关于乳蛋白抗氧化肽结构与活性关系的研究主要集中在抗氧化肽的一级结构和功能的关系方面，它们之间并不一定存在某种确切的关系，但可以肯定的是，抗氧化性与肽段中某些氨基酸的组成、数量的多少和排列顺序有关。乳蛋白肽一级结构与抗氧化活性的关系如下：

3.1 氨基酸组成

肽段的活性的强弱与疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的存在具有密切的相关性，一般地疏水性氨基酸含量越多抗氧化性越强。表4中列出近几年从乳蛋白中鉴别出的活性肽段及肽段中疏水性氨基酸的含量。Peña-Ramos等也发现在组氨酸和疏水性氨基酸的存在下，乳清分离蛋白抑制脂质氧化体系的能力明显增强[9]，原因是脂肪酸自由基会优先与抗氧化肽结合，从而使自由基链式反应终止。

肽段中Tyr和Try的存在能增强肽段的抗氧化活性，是由于Tyr和Try中的酚基和吲哚基团能作为供氢体来形成更稳定的酚基和吲哚自由基，且稳定时间较长，能抑制自由基链反应。表4中，Leila Sadat等从α-乳白蛋白中鉴别出的5个活性肽段中，在每个肽段的端极至少含有一个Tyr或Try，而且作者发现这两种氨基酸相邻会使活性更强，如101INYW104肽段比INY活性高出16倍，且高于没食子酸和维生素E的活性[29]。所以Tyr和Try两种氨基酸的数量及存在位置强烈影响着肽段的自由基清除活性[31]。

表4 乳中的抗氧化肽段及疏水性氨基酸的含量Table 4 Antioxidant peptides and percentage of the hydrophobic amino acids in milk

3.2 肽段一级结构自身的影响

Hernandez-Ledesma，Davalos，Bartolome和Amigo在β乳球蛋白中鉴定出一些肽段，其中Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile比丁基羟基茴香醚清除自由的活性强，但在氧自由基吸收能力体系中活性比色氨酸还低。肽段Met-His-Ile-Arg-Leu和Tyr-Val-Glu-Glu-Leu由于Met和 Tyr的存在而具有很强的自由基清除活性[31]。这说明在同样的氨基酸存在下，肽段的结构决定氨基酸发挥协同还是拮抗作用，决定其活性的强弱。

3.3 肽段的修饰，提高其活性

肽段可以通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰，提高其活性。Apollinaire Tsopmo利用合成肽证明了肽段清除自由基活性可以通过在肽链的N末端添加Trp或氨基的乙酰化作用来增强，对于亚油酸自动氧化体系C-末端的酰胺化、Tyr和Try的存在可以加强肽段的活性[32]。

4 展望

近年来，应用生物技术生产出大量的生物活性肽并应用于食品工业加工中，调查研究表明，生物活性肽除了营养作用外，在人体中还能发挥调节作用和生理功能，维持人体的健康。乳蛋白中的抗氧化肽和ACE抑制肽有着来源广、无毒副作用、安全可靠等优势，将更容易被人们接受。

在乳蛋白中已经鉴别出大量的抗氧化肽和ACE抑制肽，但这仅是通过体外实验来测定，进入体内后是否会被消化酶酶解而使活性降低还需要通过体内实验证明，Quiro’s等用模拟体内环境的实验来验证LHLPLP和LVYPFPGPIPNSLPQNIPP肽段在体内是否仍然具有高效的抗高血压活性，结果发现LHLPLP具有高效的抗高血压活性，而LVYPFPGPIPNSLPQNIPP被消化酶酶解活性降低[23]，因此我们需要对生物活性肽进行更深入的研究。

生物活性肽具有多种生理功能，引起了人们极大的关注，我们期待它能针对各种疾病人群发挥生理活性，治疗心血管、癌症、高血压和肥胖症等疾病。同时，乳蛋白生物活性肽可以通过饮食来预防、控制、甚至是治愈某些疾病，因此，生物活性肽的应用和发展具有广阔的前景。

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Study on relationship between the structure and bioactivity of milk-derived antihypertension peptides and antioxidant peptides

PAN Zhong-xing1，FENG Zhi-biao2，*
（1.Northeast Agricultural University，College of Food Science，Harbin 150030，China；2.Application Chemistry Department of Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）22-0436-05

2012-06-05 *通讯联系人

潘忠星（1986-），女，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏。