酶法催化乙酯甘油酯酯交换制备富含EPA和DHA的甘油酯

郭正霞，孙兆敏，张 芹，王静凤，薛长湖

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

酶法催化乙酯甘油酯酯交换制备富含EPA和DHA的甘油酯

郭正霞，孙兆敏，张 芹，王静凤，薛长湖*

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

采用国产固定化假丝酵母脂肪酶，催化乙酯型和甘油酯型鱼油酯交换制备富含EPA和DHA的甘油酯型鱼油，得到EPA和DHA总量超过45%的甘油酯。以5g甘油酯型鱼油为反应底物之一，考察了反应温度、时间、酶加量、底物质量比及加水量五个因素对酯交换反应的影响，利用正交实验优化，得到最佳反应条件为：反应温度60℃，反应时间24h，底物质量比为5∶4，加酶量为80U，不向反应体系中加入水分。在该条件下得到的甘油酯中EPA和DHA的含量分别为33.40%和13.10%，并且脂肪酶重复利用7次仍能达到工艺目标。

无溶剂体系，假丝酵母脂肪酶，n-3多不饱和脂肪酸，酯-酯交换

Abstract：The immobilized Candida sp.lipase was used as the catalyst of transesterification to prepare glycerides which contained 45%DHA and EPA totally.Transesterification was carried out with fish oil ethyl esters and triglycerides as substrates.The effect on transesterification of temperature，reaction time，enzyme dosage，substrate weight ratio and water dosage were investigated with 5g glycerides as one of the substrates.The favorable conditions obtained were：reaction temperature 60℃，reaction time 24h，the substrate weight ratio 5∶4，enzyme dosage 80U，without adding water to the reaction system.Under these conditions，the glycerides obtained contained 33.40%EPA and 13.10%DHA，and the immobilized enzyme could be used for seven times.

Key words：solvent free system；Candida sp.lipase；n-3 polyunsaturated fatty acid；transesterification

鱼油中含有的n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA），尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在人体营养健康方面具有重要作用。甘油酯型是鱼油的天然存在形式，但n-3 PUFA相对含量比较低（多在30%以下）。为了提高EPA和DHA的含量，人们多采用化学方法获得含有脂肪酸的乙醇酯，然后经过尿素包合和分子蒸馏制备得到富含EPA和DHA的乙酯型鱼油产品。但Lawson Larry等[1]和Ikeda Ikuo等[2]的研究结果表明，乙酯型鱼油在人体中的消化和吸收较困难，并且可能存在安全隐患。自上世纪九十年代至今，利用脂肪酶制备富含EPA和DHA的甘油酯是众多研究者关注的课题。目前制备富含n-3 PUFA甘油酯的方法有水解法[3-6]、酯交换法[7-10]和酯合成法[11-14]三类。其中水解法所需的具有严格1，3-位特异性的脂肪酶比较少，效率和得率都比较低，在脂肪酶将饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸从甘油骨架水解下来的同时，也会有大量EPA和DHA被水解下来，且水解法采用的油-水体系不利于脂肪酶的重复利用；酯合成法所采用的反应底物为甘油和游离脂肪酸，采用的脂肪酶多为诺维信公司生产的Novozym 435，Novozym 435价格较为昂贵，且存在甘油和脂肪酸的良好混合以及提高甘油三酯的得率等问题；酯交换法包括醇解法、酸解法和酯-酯交换法，本研究在无溶剂体系中采用脂肪酶催化乙酯型和甘油酯型的酯-酯交换反应，制备EPA和DHA总含量超过45%的甘油酯型鱼油。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙酯型鱼油 河北海源康健生物科技有限公司，EPA 43.5%、DHA 32.7%；甘油三酯型鱼油 浙江万联药业公司，EPA 21.9%、DHA 6.96%；假丝酵母脂肪酶 北京凯泰新世纪生物技术有限公司；正己烷、乙醚、乙酸、石油醚 天津博迪化工股份有限公司，分析纯。

6890N气相色谱仪 配有FID检测器，美国Agilent公司；INNOWax毛细管色谱 30m×0.32mm×0.25μm，美国Agilent公司；SHA-B水浴摇床 常州国华仪器公司。

1.2 无溶剂体系脂肪酶酯-酯交换活力的测定

分别称取5.0g三油酸甘油酯与正辛酸乙酯于25mL具塞三角瓶中，加入0.05g固定化脂肪酶，充氮密封后于60℃水浴摇床中振荡反应2h。气相色谱测定甘油酯中正辛酸含量，定义在该条件下每分钟将1μmol正辛酸转移到三油酸甘油酯所需的酶量为1个酯-酯交换酶活单位。

1.3 酯-酯交换反应

分别称取一定量甘油三酯型鱼油和乙酯型鱼油以及固定化脂肪酶，置于50mL具塞锥形瓶中，氮气吹扫后，立即用玻璃塞封口并固定，置于水浴摇床中振荡反应，进行单因素实验：

1.3.1 考察温度对酯-酯交换反应的影响 在反应时间24h、底物质量比为1∶1、甘油三酯质量为5g、固定化脂肪酶添加量为80U的条件下，选取了40、45、50、55、60、65、70℃六个数据点来考查温度因素对酯交换反应的影响。

1.3.2 考察反应时间对酯-酯交换反应的影响 在反应温度60℃、底物质量比为1∶1、甘油三酯质量为5g、脂肪酶添加量为80U的条件下，选取了6、12、18、24、36、48、60h七个数据点来考察反应时间对酯交换反应的影响。

1.3.3 考察脂肪酶添量对酯-酯交换反应的影响 在反应温度60℃、底物质量比为1∶1、甘油三酯质量为5g、反应时间为24h的条件下，选取了40、80、120、160、200U五个数据点来考查加酶量对酯交换反应的影响。

1.3.4 考察底物质量比对酯-酯交换反应的影响 在反应温度60℃、反应时间为24h、甘油三酯质量为5g、脂肪酶添加量为80U的条件下，选取了甘油三酯与乙酯的质量比为2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3六个数据点来考查底物质量比对酯交换反应的影响。

1.3.5 考察加水量对酯-酯交换反应的影响 在反应温度60℃、反应时间24h，底物质量比为1∶1、甘油三酯质量为5g、脂肪酶添加量为80U的条件下，选取了0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、8.0%五个数据点来考查加水量对酯交换反应的影响。

1.4 正交实验

根据1.3中单因素结果设计正交实验，正交实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Values and code symbols of orthogonal experiment

1.5 脂肪酶的重复利用

在1.4确定的较优条件下反应，反应完毕后静置使酶沉淀于瓶底，倒出瓶中的混合油脂，再向具塞锥形瓶中加入底物，氮气吹扫后密封，置于水浴摇床中进行后续反应。

1.6 气相色谱法测定甘油酯中EPA和DHA含量

将反应后的混合鱼油10μL点样于5×10cm TLC硅胶预制板上，在正己烷-乙醚-乙酸（85∶15∶1，V∶V∶V）中展开，碘缸中略微显色，刮下甘油酯点于10mL试管中，甲酯化后气相色谱分析其脂肪酸组成。

气相色谱条件：色谱柱：INNOWax石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm）；进样口温度240℃，分流比25∶1，进样量1μL；升温程序：起始温度170℃，以3℃/min升至210℃，保持24min；载气（高纯氮气）流速1mL/min；FID检测器参数：检测器温度250℃，氢气流速40mL/min，空气流速450mL/min，尾吹气（氮气）流速40mL/min。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 反应温度对酯交换反应的影响 由图1可知，随反应温度的提高，所得甘油三酯中EPA和DHA的总含量缓慢提高，当温度为55℃时，经过24h反应，甘油酯中EPA和DHA的总含量已经能够达到45.01%，当温度升高到65℃时总含量达到最高，继续升高温度则EPA和DHA的总含量有所下降。在实验所选的温度范围（40～70℃）内，随温度的提高，酶的活力提高，该无溶剂体系的粘度系数下降，利于反应底物和反应产物的扩散，因此得到的甘油酯中EPA和DHA的总含量提高，继续升高温度则容易导致固定化酶的不可逆失活，加剧不饱和脂肪酸的氧化。

图1 反应温度对鱼油甘油三酯和乙酯酯交换的影响Fig.1 The effect of reaction temperature on transesterification between triglycerides and ethyl esters

2.1.2 反应时间对酯交换反应的影响 由图2可知，在反应的初期，由于底物浓度较高，反应速度较快，在反应的前6h，甘油三酯中的EPA和DHA的总含量由28.9%提高到36.06%，之后的6h反应速度有所减缓，由36.06%提高到40.21%。当反应至24h时，产物甘油酯中EPA和DHA的总含量已经达到46.03%，此时反应基本达到平衡，继续延长反应时间至60h，EPA和DHA的含量缓慢提高到49.11%。

图2 反应时间对鱼油甘油三酯和乙酯酯交换反应的影响Fig.2 The effect of reaction time on transesterification between triglycerides and ethyl esters

图3 加酶量对鱼油甘油三酯和乙酯酯交换的影响Fig.3 The effect of enzyme dosage on transesterification between triglycerides and ethyl esters

2.1.3 加酶量对酯交换反应的影响 由图3可知，当反应体系中加入40U脂肪酶时，经过24h酯交换反应后，得到EPA和DHA的总含量为41.33%的甘油三酯；脂肪酶量增加一倍，得到的甘油酯中EPA和DHA的总含量可达到46.12%，继续增加脂肪酶的用量可使EPA和DHA的总含量达到47%以上，但当脂肪酶添加量为160U时反应达到平衡，继续增大脂肪酶量无助于甘油酯中EPA和DHA含量的提高。

2.1.4 底物质量比对酯交换反应的影响 由图4可知，当底物质量比为2∶1时，经过24h的酯交换反应，鱼油甘油三酯中EPA和DHA的总含量为36.53%，底物质量比为1∶1时提高到46.07%，乙酯型鱼油对甘油三酯的比例从1∶1增加到3∶1的过程中，产物甘油三酯中EPA和DHA的总含量缓慢增加。

图4 底物质量比对鱼油甘油三酯和乙酯酯交换反应的影响Fig.4 The effect of substrate ratio on transesterification between triglycerides and ethyl esters

从图4中的实验结果可以看出，底物中乙酯比例的提高，有利于富集DHA和EPA于甘油三酯中。应该可以推测出，加大乙酯鱼油的比例，可以在实现工艺目标的同时，减少反应时间，避免脂肪酶长时间处在较高温度下，利于脂肪酶的稳定，但乙酯比例的提高也伴随着后期分离成本的提高，所以最高只考察了3∶1的配比。

2.1.5 加水量对酯交换反应的影响 由图5可知，当反应体系中不添加水分时，在所述的反应条件下得到甘油酯中EPA和DHA的总含量在45%以上，加入0.5%（占底物总质量）水后，EPA和DHA的总含量下降到39.73%，继续加大水量则EPA和DHA的含量继续降低，反应体系中甘油二酯和单甘油酯的含量明显增加，当加水量达到5%后，继续加大水量至8%，得到甘油酯中EPA和DHA的总含量变化不大。

图5 加水量对鱼油甘油三酯和乙酯酯交换反应的影响Fig.5 The effect of water dosage on transesterification between triglycerides and ethyl esters

在一定范围内，脂肪酶含水量越高，其对热的稳定性越低，由于水的加入，导致脂肪酶含水量增加，其在反应体系中的稳定性降低，不利于脂肪酶的重复利用。不仅如此，水量的增加，利于水解反应的进行，一方面甘油三酯被水解导致其得率降低，另一方面乙酯被水解之后产生乙醇和脂肪酸，乙醇在反应体系中的出现会导致部分脂肪酶的失活。

2.2 正交实验

根据2.1中单因素实验所得实验结果，设计四因素三水平正交实验，实验结果如表2所示。

表2 正交实验结果及分析Table 2 Results and analysis of the orthogonal experiment

根据表2中的R值可知，在所选的因素水平范围内，对酯交换结果影响最大的是反应时间，其次是加酶量，反应影响最小的是底物质量比。其中最优条件为A3B3C1D2，即反应温度为60℃，反应时间24h，底物质量比为5∶4，加酶量为80U，在该条件下得到的甘油酯中EPA和DHA的含量分别为33.40%和13.10%。

2.3 脂肪酶的重复利用

目前，脂肪酶昂贵的价格是制约其在油脂工业应用的重要因素。为了降低工艺成本，除了筛选较为廉价的脂肪酶，还应当从脂肪酶的重复利用入手。工艺条件中的反应体系、温度、时间、水分含量、反应底物及产物等都会影响脂肪酶的稳定性，另外，脂肪酶的固定化方式也会影响脂肪酶的利用次数。

在较优条件，即反应温度60℃、反应时间24h、底物质量比为5∶4、加酶量为80U的条件下，重复利用脂肪酶催化酯交换反应。由图6可知，当重复利用脂肪酶至第七次时，仍能实现工艺目标，催化第八次反应得到的甘油酯中EPA和DHA含量为44.76%，第九次为43.32%，因此在连续反应的过程中，需要在第七次反应后适当补加脂肪酶才能保证达到工艺目标。

实验采用的国产脂肪酶虽然较进口脂肪酶廉价，但在较优的工艺条件下，可重复利用并达到工艺目标的次数较少，可能与反应温度和时间有关。通过进一步优化工艺条件，尤其是降低反应温度，缩短反应时间，可能会提高脂肪酶的利用次数；另外，由于该国产固定化脂肪酶采用的固定化载体为无纺布（需将整块酶布剪碎使用），在振荡反应过程中脂肪酶极易脱落；同时，改变固定化酶的载体（如大孔吸附树脂），也可能会提高固定化酶的重复利用次数。

图6 脂肪酶的重复利用Fig.6 The reutilization of lipase

2.4 脂肪酸组成分析

由表3可看出，在较优条件下反应，反应后鱼油甘油酯中EPA含量由21.91%增长为32.40%，DHA含量由6.96%增长到13.10%；反应后鱼油乙酯中EPA含量由43.5%降低为35.45%，DHA含量由32.7%降低至20.39%。经24h酯交换反应后，原鱼油甘油三酯中的少量长链饱和脂肪酸如豆蔻酸、硬脂酸等也通过酯交换反应形成乙酯。对于反应后的鱼油乙酯，可通过分子蒸馏与甘油酯分离，并再次通过分子蒸馏提高其中EPA和DHA的含量。

表3 反应前后脂肪酸的组成的比较（%）Table 3 Comparison of the fatty acid before and after reaction（%）

3 结论

利用国产固定化假丝酵母脂肪酶催化鱼油乙酯（EPA和DHA含量为76.2%）和甘油三酯（EPA和DHA含量为28.87%）的酯交换反应，得到EPA和DHA总量超过45%的甘油酯。通过单因素实验及正交实验得到了较优的工艺条件：反应温度60℃，反应时间24h，底物质量比为5∶4，加酶量为80U，不向反应体系中加入水分。在该条件下酶反应得到的甘油酯中EPA和DHA的含量分别为33.40%和13.10%，在该条件下脂肪酶重复利用7次仍能达到工艺目标。

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Preparation of glycerides rich in EPA and DHA by lipase-catalyzed transesterification between ethyl esters and triglycerides

GUO Zheng-xia，SUN Zhao-min，ZHANG Qin，WANG Jing-feng，XUE Chang-hu*
（Food Science and Engineering College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

TS254.5+3

B

1002-0306（2012）20-0215-05

2012-05-04 *通讯联系人

郭正霞（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：水产化学。

“泰山学者”建设工程专项经费；国际科技合作项目（2010DFA31330）；长江学者和创新团队发展计划。