寻常型银屑病患者皮损中HBD-2和TNF-α的表达及意义①

王 琳 甄 莉 (山西医科大学第一医院皮肤科，太原030001)

银屑病是一种常见且易复发的慢性炎性皮肤病，其病因及发病机制尚未完全清楚。近期的研究越来越关注抗微生物肽表达失调在银屑病发病机制中的作用［1］。HBD是抗微生物肽家族成员之一，不仅具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等生物活性还是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁［2］。适量表达有抗微生物作用，过量表达意义尚不清楚。TNF-α作为促炎症因子，在银屑病的发生、发展中起着重要作用，且大量研究表明，在体外实验中TNF-α能促进HBD-2产生［3］。本实验采用实时荧光 PCR(RTPCR)检测寻常型银屑病皮损处HBD-2及TNF-α mRNA的表达，进一步揭示二者之间的关系和在银屑病发病中的作用。

1 材料与方法

1．1 对象 进行期寻常型银屑病患者45例，男25例，女20例;年龄在18～65岁，平均年龄31．8岁。问诊排除取材前3个月内系统使用过糖皮质激素、维A酸、免疫抑制剂等药物、光疗，2周内使用过外用药物，以及合并其他内脏疾病者。45例患者的银屑病皮疹面积和严重程度指数(PASI评分)为6．9～55．2，按评分再将患者分为三组:＜24 为轻度组，25例;24～48为中度组，12例;＞48为重度组，8例。皮损标本均取自躯干或四肢的典型皮损，在距离皮损＞1 cm处切取外观正常的皮肤作为非皮损。正常对照组皮肤来自我院整形科手术切除的正常皮肤组织。标本取下后，均立即液氮冷冻，－70℃冰箱保存。

1．2 实验材料

1．2．1 主要仪器与设备 TL988型实时荧光定量PCR仪(西安天隆科技有限公司);Y200C型电泳仪及JY-SCZ型电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)。

1．2．2 实验试剂 Transzol溶液、DNA marker由北京全式金生物技术有限公司生产;PrimeScript®RT试剂盒及SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司。

1．2．3 引物设计及合成 引物设计参照GenBank序列，应用Primer Premier 5．0软件设计，确定序列后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。设β-actin为内参照基因，其上游引物:5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，下游引物:5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，预期扩增片段184 bp。HBD-2上游引物:5'-ATTCCTGATGCCTCTTCC-3'，下游引物:5'-GTGCCAATTTGTTTATACCTTC-3'，预期扩增片段 117 bp。TNF-α上游引物:5'-TCCTTCAGACACCCTCAACC-3'，下游引物:5'-AGGCCCCAGTTTGAATCCTT-3'，预期扩增片段173 bp。

1．3 方法

1．3．1 提取总RNA 严格按照Transzol溶液试剂盒说明书进行操作提取，提出的RNA用紫外分光光度计测定其纯度浓度，保存样品于－70℃备用。

1．3．2 逆转录合成 cDNA 反应体系10 μl:5×PrimeScript® Buffer 2 μl，Prime Script® RT Enzyme Mix I 0．5 μl，Oligo dT Primer 0．5 μl，Random 6 mers 0．5 μl，Total RNA 2 μl ，RNase Freed H2O 4．5 μl。反应条件:37℃15分钟 ，85℃5秒。

1．3．3 RT-PCR步骤 按照逆转录试剂盒说明书进行RT反应，25 μl反应体系:SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 12．5 μl ，PCR Forward Primer 1 μl，PCR Reverse Primer 1 μl，DNA 模板 2 μl，灭菌蒸馏水 8．5 μl。预变性:95℃ 30秒1个循环。PCR反应:95℃5秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，40个循环。反应结束后，读取Ct值。

1．3．4 PCR产物电泳和相对定量分析 取PCR扩增产物5 μl于琼脂糖凝胶中电泳，以5 V/cm电泳20分钟，紫外灯下观察结果并摄影。结果显示各组均有预期的阳性片段。经测定目标基因和内标基因的扩增效率相同，通过△△CT值法计算其相对表达量。

1．4 统计学分析 统计学处理结果使用SPSS17．0统计软件进行统计分析，所得数据以x±s表示，相关性采用pearson或spearman相关分析;多组比较采用Kruskal-Wallis秩和检验;P＜0．05为差异有统计学意义;组间两两比较采用Bonferroni法，校正检验水准后 α'=0．017，P ＜0．017 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 HBD-2 mRNA和TNF-α mRNA的表达在寻常型银屑病皮损组显著高于非皮损组和正常对照组(P ＜0．01);非皮损组高于正常对照组(P ＜0．01)。见表1。

2．2 在银屑病皮损中HBD-2 mRNA与TNF-α mRNA的表达均成正相关，相关系数为r=0．81;P＜0．01。

2．3 HBD-2 mRNA和TNF-α mRNA的表达在银屑病患者重度组显著高于中度和轻度组(P＜0．01);中度组高于轻度组(P＜0．01)。见表2。

2．4 在银屑病皮损中HBD-2 mRNA及TNF-α mRNA的表达均与患者的PASI评分成正相关，相关系数分别为 r=0．89、r=0．79;P 值均 ＜0．01。

3 讨论

银屑病的发病机制目前尚不清楚，近年来多认为银屑病是免疫介导的疾病，促炎因子如TNF-α、IL-1等在银屑病的发病中扮演着重要的角色。Grone等［4］研究发现 TNF-α 刺激角质形成细胞增殖;并诱导角质形成细胞和血管内皮细胞表达细胞间粘附分子(ICAM-1)，为中性粒细胞与淋巴细胞提供粘附位点，活化中性粒细胞与血管内皮细胞，释放炎性介质，加剧局部的炎症反应，产生典型银屑病皮损［5］。

表1 对照组、非皮损组及皮损组HBD-2、TNF-α mRNA表达(x±s)Tab．1 The mRNA expression of HBD-2 and TNF-α in lesional skin，noninvolved skin and normal controls(x±s)

表2 轻度组、中度组及重度组HBD-2、TNF-α mRNA表达(x±s)Tab．2 The mRNA expression of HBD-2 and TNF-α in mild group，moderate group and severe group(x±s)

银屑病患者皮肤屏障功能严重受损但却很少发生感染，其原因之一就是Schroder等［6］在银屑病皮损中发现的HBD-2的高表达。HBD的高表达不仅可以预防感染，可能和银屑病的发病也存在着某种密切的关系，Hollox等［7］对银屑病患者和正常对照的8号染色体的HBD区域进行基因多态性分析，发现HBD-2基因的拷贝数与银屑病的发生呈正相关。

HBD-2可被多种细胞因子诱导产生。Joly等［8］用 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ 和LPS刺激牙龈角质形成细胞，对其表达的HBD-2进行定量分析，发现其中TNF-α和IL-1β是导致HBD-2的表达最主要原因。Gambichler等［1］发现银屑病患者经依那西普(TNF-α受体阻滞剂)治疗后PASI评分及皮损中HBD-2较治疗前明显下降，认为依那西普诱导的银屑病病变的改善与HBD-2等表达明显下降有关。而研究表明HBD-2又可反过来刺激TNF-α的产生。Kanda等［9］研究发现 HBD-2可作为刺激因子，通过JNK等途径促进TNF-α等细胞因子的产生。本研究表明:HBD-2和TNF-α在寻常型银屑病皮损中的表达均升高，且HBD-2和TNF-α存在正相关，并且二者的表达随银屑病患者病情严重程度的增加而增加，和银屑病PASI评分成显著的正相关。常玉英等［10］研究表明 HBD-2的高表达与TNF-α共同作用可加剧炎症反应，以及本实验的结果推测:作为固有免疫和获得性免疫的桥梁的HBD-2和TNF-α之间可能存在着相互作用，相互诱生的关系。HBD-2的高表达是一把双刃剑在防御感染的同时，也可能扩大炎症反应，与TNF-α等促炎因子共同参与了银屑病的发病过程。

1 Gambichler T，Kobus S，Kobus A et al．Expression of antimicrobial peptides and proteins in etanercept-treated psoriasis patients［J］．Regul Pept，2011;167(2-3):163-166．

2 Yang D，Chertov O，Bykovskaia S N et al．β-defensins:linking innate and adaptive immunity through dendritic and t cell CCR6［J］．Science，1999;286(5439):525-528．

3 Gisondi P，Gubinelli E，Cocuroccia B et al．Targeting tumor necrosis factor-alpha in the therapy of psoriasis［J］．Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2004;3(2):175-183．

4 Grone A．Keratinocytes and cytokines［J］．Vet Immunol Immunopathol，2002;88(1-2):1-12．

5 McKenzie R C，Sabin E．Aberrant signalling and transcription factor activation as an explanation for the defective growth control and differentiation of keratinocytes in psoriasis:A hypothesis［J］．Exp Dermatol，2003;12(4):337-345．

6 Schroder J M，Harder J．Human beta-defensin-2［J］．Int J Biochem Cell Biol，1999;31(6):645-651．

7 Hollox E J，Huffmeier U，Zeeuwen P L et al.Psoriasis is associated with increased β-defensin genomic copy number［J］．Nat Genet，2008;40(1):23-25.

8 Joly S，Organ C C，Johnson G K et al．Correlation between beta-defensin expression and induction profiles in gingival keratinocytes［J］．Mol Immunol，2005;42(9):1073-1084．

9 Kanda N，Kamata M，Tada Y et al．Human β-defensin-2 enhances IFN-γ and IL-10 production and suppresses IL-17 production in T cells［J］．J Leukoc Biol，2011;89(6):935-944．

10 常玉英，欧阳钦．防御素在小鼠噁唑酮结肠炎粘膜中的表达及意义［J］．胃肠病学，2007;12(2):96-100．