青海土族人群HLA-A、B、DRB1基因多态性分析①

马 兰 靳国恩 杨应忠 韵海霞 白振忠 格日力

(青海大学医学院高原医学研究中心，西宁810001)

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)系统是一群与人的免疫应答反应密切相关的基因簇，定位于6p21．31区，长3 600 kb，是目前所知人体内最复杂的显性多态及免疫遗传系统，成为研究人类群体遗传特征的最佳遗传标志。研究表明，HLA等位基因的分布具有显著的种族、地域特异性，并且由于HLA等位基因间存在连锁不平衡，其分布也具有明显的种族和地域差［1，2］。因此，对不同地域的聚居少数民族进行HLA等位基因频率的研究，了解其分布特征，对寻找HLA相合无关供者具有实际意义;同时也可以为人类学、免疫遗传学、法医学、疾病相关性研究等提供和积累基础资料。土族是青海省特有的民族，分布比较集中，民族间通婚现象比较少，其基因的保守性强，形成自己独特的遗传基因频率分布。我们采用聚合酶链反应-直接测序分型(Polymerase chain reaction sequencebased typing，PCR-SBT)方法对青海土族地区人群中47名健康无关个体进行HLA-A、B、DRB1基因座高分辨分型，从而了解青海土族人群中HLA等位基因分布情况及特点。

1 对象与方法

1．1对象 青海土族地区健康人47名，其中男性14名，女性33名。

1．2 主要仪器试剂 ABI29700型PCR扩增仪、蛋白酶-K、TaqDNA聚合酶(华美生物公司);BigDye®Terminator测序试剂盒、ABI-3730XL型DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster city，CA，USA)。

1．3 基因组DNA制备 静脉采血2 ml，加EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝后于－20℃冷冻保存;根据微量快速盐析法使用蛋白酶-K从外周血白细胞中提取基因组DNA;使用琼脂糖凝胶电泳法收集、纯化并测定DNA浓度。

1．4 PCR扩增 取10 μl PCR引物混合物(其中含有HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1的2对、1对、7对组特异性正反向引物)，加入3．0 μl上述DNA稀释液，进行PCR扩增。PCR反应条件:96℃2分钟、96℃ 30秒;60℃ 30秒，72℃ 1分钟，35个循环;最后72℃10分钟。

1．5 测序反应 5 μl特异性测序反应体系(其中含有HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1的3对、2对、1对组特异性正反向引物)，含有1 μl PCR纯化产物。测序反应条件:96℃2分钟;96℃10秒，50℃5秒，60℃ 4分钟，25个循环;4℃保温。在纯化测序反应产物后使用荧光标记双脱氧法测序。

1．6 等位基因识别 使用Sequencing AnalysisTM、MatchToolsTM、MT NavigatorTM(Applied Biosystems ，Foster City，USA)系列软件对数据进行处理并识别等位基因。

1．7 统计学分析 直接计数法计算 HLA-A、B、DRB1基因频率、基因型频率。

2 结果

2．1 Hardy-Weinberg 平衡检验 HLA-A、B、DRB1基因座分别经Hardy-Weinberg吻合度检验，期望值与观察值无显著差异(P＞0．05)，说明该研究群体的基因分布具有代表性。

2．2 青海土族人群HLA-A、B、DRB1等位基因频率分布特征 在本研究中，47名青海土族地区健康无关个体的HLA-A位点上共检出34种基因型和17种等位基因(表1)，最常见5种按频次由大到小分别 为 110101/240201、110101/310102、020101/110101、020101/240201、020301/110101 和 110101、240201、020101、330301、310102;B 位点上共检出 41种基因型和28种等位基因(表2)，最常见5种按频次由大到小分别为150101/5401、150101/510101、380201/5801、4601/510101、 510101/550201 和510101、150101、3503、5801、4601;DRB1 位点上共检出42种基因型和30种等位基因(表3)，最常见的5种按频次由大到小分别为040501/090102、040501/120201、120101/140101 和 040501、140101、070101、090102、110101。

2．3 青海土族人群与不同人群HLA-DRB1等位基因频率分布特征比较 由表4可见，青海土族HLADRB1等位基因频率分布与蒙古族有相似之处，表现为:DRB1*04，DRB1*07，DRB1*09，DRB1*12等位基因频率较高。DRB1*02，DRB1*03，DRB1*16等位基因频率低。

表1 青海土族人群HLA-A等位基因频率分布(n=47)Tab．1 The allele distribution frequency of HLA-A in Tu nationality of Qinghai Province(n=47)

表2 青海土族人群HLA-B等位基因频率分布(n=47)Tab．2 The allele distribution frequency of HLA-B in Tu nationality of Qinghai Province(n=47)

表4 青海土族人群与国内其他民族HLA-DRB1等位基因频率比较(%)Tab．4 Compare the HLA-DRB1 allele gene frequency between Tu nationality in Qinghai and domestic other nationalities

表3 青海土族人群HLA-DRB1等位基因频率分布(n=47)Tab．3 The allele distribution frequency of HLA-DRB1 in Tu nationality of Qinghai Province(n=47)

3 讨论

HLA等位基因系统是已知人类最复杂的显性多态遗传系统，成为研究人类群体遗传特征的最佳遗传标志。国外已对不同人种和民族的HLA分布情况作了大量的调查和研究，国内关于HLA群体遗传学的研究也在不断地深入。群体HLA基因多态性的研究在追溯人类(民族)起源、进化、迁徙、融合等人类遗传学研究，法医学个体识别，干细胞和器官移植以及疾病相关性研究等诸多方面有较大的应用价值和重要意义［7-9］。

土族是中国人口较少的民族之一，现有人口大约接近20万。主要聚居于青海省东部湟水以北、黄河两岸及其毗连地区。青海省境内的土族约占全国土族总人口的85%。长期以来，土族族源问题一直受到民族史和地方史学界的关注，至今仍存在争论，主要有吐谷浑说、蒙古人或以蒙古人为主融合霍尔人等各族说等［10］。本研究运用PCR-SBT技术方法对青海土族人群中的HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1基因多态性进行分析，在HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1基因座分别检出34、41、42个基因型和17、28、30个等位基因。其中HLA-A的基因型和等位基因分别以 10101/240201、110101/310102、020101/110101、020101/240201、020301/110101 和 110101、240201、020101、330301、310102常见，HLA-B 的基因型和等位 基因分别以 150101/5401、150101/510101、380201/5801、4601/510101、510101/550201 和 510101、150101、3503、5801、4601 常见，HLA-DRB1 的基因型和等位基因分别以040501/090102、040501/120201、120101/140101 和 040501、140101、070101、090102、110101常见。这表明，青海土族人群HLA基因座的基因型和等位基因具有较高的遗传多态性，而且具有其自身的特点。此外，我们还对青海土族人群的HLA-DRB1等位基因频率分布与国内其他民族做了比较，发现青海土族HLA-DRB1等位基因频率分布与蒙古族确实有相似之处，表现为:DRB1*04，DRB1*07，DRB1*09，DRB1*12等位基因频率较高。DRB1*02，DRB1*03，DRB1*16等位基因频率低。这一结果与曹海霞等［9］的报道是基本一致的。但由于样本资料有限，结果在一定程度上可能会存在误差，今后还需加大样本量开展更深入的研究，从遗传背景的角度为解释土族的历史源流提供一定的数据资料。

1 Shankarkumar U，Sridharan B，Pitchappan R M．HLA diversity among Nadars，a primitive Dravidian caste of south India［J］．Tissue Antigens，2003;62(6):542-547．

2 Ivanova M，Rozemuller E，Tyufekchiev N et al．HLA polymorphism in Bulga-rians defined by high resolution typing methods in comparison with other populations［J］．T issue Antigens，2002;60(6):496-504．

3 沈春梅，朱波峰，李生斌．内蒙古地区蒙古族HLA-A，B，DRB1基因多态性研究［J］．遗传，2008;30(2):164-168．

4 侯 玲，刘 杰，李 鑫 et al．黑龙江地区蒙古族 HLA-A、B、DRB1等位基因及单体型的研究［J］．中国输血杂志，2010;23(11):929-933．

5 沈春梅，朱波峰，刘孟黎 et al．宁夏回族HLA-A，B，DRB1基因座遗传多态性和单倍型分析［J］．第四军医大学学报，2008;29(17):1540-1543．

6 赖淑苹，任惠民，胡海涛et al．中国西北地区汉、回维、民族HLADRB基因多态性的研究［J］．遗传学报，1999;26(5):447-457．

7 宋艳萍，张 梅，赖淑苹et al．中国西北地区汉族、维吾尔族HLA-A基因频率的分布差异［J］．陕西医学杂志，2008;37(6):646-741．

8 Yari F，Sobhani M，Sabaghi F et al．Frequencies of HLA-DRB1 in I-ranian normal population and in patients with acute lymphoblastic leukemia［J］．Arch Med Res，2008;39(2):205-208．

9 曹海霞，徐 昕，洪 军．青海土族人群HLA-DRB1等位基因多态性分析［J］．中国免疫学杂志，2008;24(11):1018-1020．

10 孟 航．浅析中国土族人口分布格局及其社会发展［J］．青海民族研究，2005;16(4):22-29．