一例猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

韩 勇

（日照市动物疫病预防控制中心，山东日照 276800）

伪狂犬病（pseudorabies，PR）是猪疱疹病毒Ⅰ型引起的一种多种家畜感染得的急性传染病。其特征为发热、奇痒及脑脊髓炎，可引起妊娠母猪繁殖障碍、流产、死胎、呼吸症状，新生仔猪除出现神经症状外还可侵害消化系统。临床症状主要表现为腹泻、呕吐、生长不良等。在自然条件下猪、牛、绵羊、犬、猫、兔、鼠等及多种野生动物都能发生感染。试验结果证实猪和鼠类是自然界中病毒的主要贮存宿主，也是引起其他家畜发病的疫源动物。猪既是本病原的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用。山东省日照市某猪场发生临床症状相似的传染病，从病猪脑部采集病料，对病毒进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料 可疑病料采自山东省日照市某猪场病猪脑部，PRV阳性血清、PRV阴性血清和PRV标准强毒株（闽A株）、PK-15细胞均由日照市动物疫病预防控制中心试验室保存。

1.2 试验试剂 明胶、DMFM购J-Sigma公司，新生犊牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.3 病料处理 无菌取病猪脑部与PBS（0.1 M，pH7.2）以V/V 1:5制成匀浆，反复冻融3次，3 000 r/min，离心15 min，取上清中加双抗，37 ℃作用18 h，经0.45 μm滤膜除菌。

1.4 小鼠接种试验 取10只8周龄Balb/c小鼠，其中4只腹腔注射病料滤液，0.2 mL/只，另4只背部脊柱附近皮下注射病料滤液，0.2 mL/只，接种后观察小鼠的采食、饮水、精神状况及临床表现。

1.5 细胞接种试验 接种0.5 mL病毒滤液于长成单层的细胞，连续观察，直到出现细胞病变（CPE）为止。

1.6 分离毒的毒价 滴定PK-15细胞培养于96孔细胞板上，待细胞生长成单层，分离病毒作10倍系列稀释（病毒浓度为10-1～10-10），每个稀释度接种8孔。每孔0.1 mL，第11、12列为空白对照。记录各个梯度的病变数，连续观察5 d，用Karber法计算出分离毒的TC1D50[1]。

1.7 微量中和试验鉴定分离毒（固定病毒稀释血清法）将PRV阴性血清和阳性血清分别进行10倍系列稀释（血清浓度为10-1～10-10），加等量的200 TCID50，37 ℃感作20 min。分别接种96孔板单层PK-15细胞，每孔0.1 mL。每个稀释度接种8孔，第11列为空白对照，第12列为标准强毒株对照（200TC1D50）。记录各个梯度的细胞病变数，连续观察5 d。同时设标准强毒株（闽A株）与阳性血清及标准强毒株（闽A株）与阴性血清对照，方法同上。

1.8 引物设计 根据基因库的PRV gE基因设计1对引物鉴定该病毒。

上游引物：5'-agt act cgc agg ggc gca act -3'下游引物3'-tgt gga tgt ggt tct agc cgc-5'

1.9 聚合酶链式反应（PCR）

将病毒接种PK-15细胞，当细胞病变达80%以上时收集细胞。用常规方法提取病毒DNA，用TE溶液溶解沉淀，分装备用-70 ℃冻存[2]，按照宝生物工程（大连）有限公司LA PCR试剂盒说明进行扩增。反应程序 94 ℃ 5 min、94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、2 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共进行30个循环。最后取PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

2 结果与分析

2.1 小鼠接种试验 小鼠接种病料12 h后，打盹、不爱活动。其中1只小鼠出现后肢麻痹，可能是病毒侵入神经引起麻痹，48 h后2只小鼠出现被毛逆立，60 h后3只小鼠死亡，直到72 h共死亡6只。

2.2 细胞病变的观察 PH-15细胞接种病料12 h后出现空洞、细胞变圆，第24 h出现明显的拉网病变，48 h细胞脱落。

2.3 分离毒的毒价滴定 不同稀释度的病毒在96孔细胞板PK-15细胞单层出现的CPE，结果见表1，参照公式TC1D50= 1，+ d（S-0.5）[3]计算该病毒在V ero细胞培养物的毒价为10-9.45/0.1 mL。

2.4 微量中和试验结果分析 PRV阳性血清特异中和分离毒，抑制细胞病变，说明所分离的病毒是伪狂犬病毒。

表1 不同稀释度的病毒出现的CPE

2.5 PCR反应结果分析 琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明，扩增出的片段大小约为485 bp，与预期长度相符。如下图1。

3 讨论

分离伪狂犬病毒可以将采集的样品匀浆接种易感细胞加以增殖，通过特异性抗血清中和试验检测特异性细胞病变加以鉴定，还可以用PCR来鉴定。作者从急性死亡病猪脑部分离出的病毒，经过动物接种试验、细胞接种试验及对其毒价进行滴定初步判断其为伪狂犬病毒；经中和试验PRV阳性血清能够特异中和分离毒，抑制细胞病变；根据PRV gE基因设计的引物对分离毒DNA进行PCR反应，可扩增出特异性条带。以上结果，鉴定分离毒为伪狂犬病毒。

[1]杜念兴.兽医免疫学[M].北京：中国农业出版社，1995：589-590.

[2]殷震.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：988-1009.

[3]范伟兴，刘文强.三种PCR方法诊断猪伪狂犬病的比较研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（4）：294-298.