傣医解药雅解沙把对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用△

吴爱萍 代 蓉 李相融 王 辉 薛 静 张 超 淤泽溥

(云南中医学院，云南 昆明 650500)

傣医认为“雅解(解药)”能调节人体生理功能、解除人体的各种毒素，保持体内“四塔五蕴”功能的平衡和协调。“雅解”方药在疾病的防治中发挥重要的作用，临床应用十分广泛。课题组前期实地调研、收集、整理及西双版纳州傣医院等单位进行的初步临床研究结果表明，多种傣医解药具有一定的保肝作用，对肝病、消化系统疾病、代谢性疾病等均有肯定的疗效。我们选用有长期临床应用基础的“雅解”方中的代表方——西双版纳州傣医院的院内制剂“雅解沙把”进行保肝作用的研究。

减少毒物对机体的损伤可能是解药“雅解沙把”解毒的作用机制之一，肝脏是体内血流最丰富的器官，也最容易受到毒物的损伤。本实验在傣医基础理论为指导下，对通过研究“雅解沙把”对小鼠急性化学性肝损伤模型血清转氨酶的影响，为其临床用于防治肝损伤提供实验依据，也为进一步研究其“解毒”作用机制的特点提供理论支持。

1 实验材料

1．1 动物:昆明种小鼠，清洁级，雌雄兼用，体重18～22g。均购自四川省医学科学院实验动物研究所，许可证号:SCXK(川)2008－24。

1．2 药物:“雅解沙把”(百解胶囊)，滇药制字(Z)20082252K，0．2g×60 粒/瓶，5 粒/次，每日 次;由西双版纳州傣医院提供。联苯双酯滴丸:国药准字H33020232，1．5mg×250丸/瓶，5粒/次，每日3次;浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号:100409、101004。茵栀黄口服液:北京双鹤高科天然药物有限责任公司，批号:272421。

1．3 试剂:四氯化碳(CCl4):分析纯，≥99．5%，武汉联碱厂，批号:20040310。D－氨基半乳糖(D－Galn):≥99%，为sigma公司产品。对乙酰氨基酚(AAP):瑞士admas公司产品，批号:T03171。硫代乙酰胺(TAA):瑞士admas公司，批号:T3533。α－萘异硫氰酸酯(ANIT):acros公司，批号:A0298308。丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，批号:20110228、20110624、20111031;天冬门氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，批号:20110620、20111101;总胆红素(Tbil)测定试剂盒，批号:20111111;以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1．4 仪器:Infinite M200 PRO酶标仪:瑞士Tecan公司;UV－N2550紫外分光光度计:日本岛津公司;CF16 RXⅡseries冷冻离心机:日本HITACHI公司;XS125A电子分析天平:瑞士Precisa公司;UB－7 pH计:;美国丹佛仪器公司(DENVER INSTRUMENT);HW－80A旋涡混合器:上海精科实业有限公司;HH－6数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

2 方法和结果

2．1 “雅解沙把”剂量选择及药物制备:按人和动物的体表面积计算法，计算得出“雅解沙把”小鼠口服给药的等效量为0．39g生药/kg，再参考前期完成的“雅解沙把”抗炎、解酒等实验的有效剂量为9倍临床等效剂量，故本实验选择3．51g生药/kg、0．39g生药/kg为高、低剂量，此剂量相当于临床用剂量的9倍和1倍。

取“雅解沙把”生药粉末250g，用无纺布袋分装后包煎，第一次加3倍量水煎煮，煮沸计时，30min后过滤;第二次加2倍量水煎煮，煮沸计时，20min后过滤;第3次加2倍量水煎煮，煮沸计时，20min后过滤。将三次滤液合并，浓缩成稠浸膏，置冰箱中冷藏保存备用，临用前按剂量现配至所需浓度。

2．2 “雅解沙把”对CCl4致急性肝损伤模型小鼠血清ALT的影响:参考文献［1］方法，取雄性昆明种清洁级小鼠75只，按体重与性别随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组、雅解沙把高、低剂量组，每组动物15只。按分组分别等体积灌胃给予相应药物，正常组和模型组给予等体积1%CMC －Na，1次/d，连续用药6d，第6 日给药后30min，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射0．2%的CCl4橄榄油溶液0．1ml/10g．bw，造模后禁食不禁水20h，第7日再给药一次，末次给药后30min，摘眼球取血，以r/min离心15min，分离血清，按试剂盒(赖氏法)操作方法测定血清ALT。实验结果见表1，“雅解沙把”高剂量组小鼠血清ALT低于CCl4致肝损伤模型组 (P ＜0．01)，低剂量组有作用趋势(P ＞0．05)。

表1 “雅解沙把”对CCl4致急性肝损伤模型小鼠血清ALT的影响(+s)

表1 “雅解沙把”对CCl4致急性肝损伤模型小鼠血清ALT的影响(+s)

注:与正常组相比:0△△P ＜0．01;与模型组相比，＊＊P ＜0．01

分组 剂量(/kg) 动物数(只) ALT(IU/L)正常20ml 15 15．09 ±3．70模型 20ml 12 148．25 ±28．52△△联苯双酯 200mg 14 100．46 ±34．30＊＊雅解高 3．51g 15 100．36 ±37．42＊＊雅解低0．39g 14 113．05 ±40．88

2．3 “雅解沙把”对D－Galn致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响:参考文献［2，3］方法，取昆明种清洁级小鼠70只，雌雄各半，分组给药同2．2。不同者为每组动物14只，正常组和模型组给予等体积蒸馏水，连续用药7d。末次给药1h后，除正常组腹腔注射等量生理盐水(NS)外，其余4组分别按0．08ml/10g．bw腹腔注射800mg/kg DGaln，给药后24h，摘眼球取血，分离血清，按试剂盒(赖氏法)操作方法分别测定ALT、AST。实验结果见表2，“雅解沙把”高剂量组小鼠血清ALT低于D－Galn肝损伤模型组(P＜0．05)，而对抑制AST的升高仅有作用趋势(P ＞0．05)。

表2 “雅解沙把”对D－Galn致肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响(+s)

表2 “雅解沙把”对D－Galn致肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响(+s)

注:与正常组相比:△△P ＜0．01;与模型组相比:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

分组 剂量(/kg) 动物数(只) ALT(IU/L) AST(IU/L)正常20ml 12 8．57 ±2．61 9．51 ±1．87模型 20ml 13 58．48±33．71△△ 32．60±19．54△△联苯双酯 200mg 13 15．33±11．68＊＊ 13．17±3．89＊＊雅解高 3．51g 12 24．97 ±14．60* 19．57 ±10．47雅解低0．39g 12 56．93 ±26．34 28．77 ±17．23

2．4 “雅解沙把”对AAP致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响:参考文献［4，5］方法，取昆明种清洁级小鼠80只，雌雄各半，分组给药同2．3。不同者为每组动物16只，除正常对照组外，其余4组分别灌胃给予500mg/kg AAP，给药24h后，按前述方法测定ALT、AST。实验结果见表3，“雅解沙把”高剂量组小鼠血清ALT低于AAP致肝损伤模型组(P＜0．05)，而对抑制AST的升高有作用趋势(P ＞0．05)。

表3 “雅解沙把”对AAP致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响(—χ+s)

2．5 “雅解沙把”对TAA致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响:参考文献［6－8］方法，取昆明种清洁级小鼠70只，雌雄各半，分组给药同2．3。不同者为，除正常组腹腔注射等量NS外，其余4组分别腹腔注射100mg/kg－TAA溶液，给药16h后(禁食不禁水)，按前述方法测定ALT、AST。实验结果见表4，“雅解沙把”高剂量组对降低TAA致小鼠血清ALT的升高有作用趋势(P＞0．05)。

表4 “雅解沙把”对TAA致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响(+s)

表4 “雅解沙把”对TAA致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响(+s)

注:与正常组相比:△△P ＜0．01;与模型组相比:*P ＜0．05

分组 剂量(/kg) 动物数(只) ALT(IU/L) AST(IU/L)正常20ml 13 10．41 ±4．67 15．01 ±3．28模型 20ml 12 113．47±39．08△△ 77．41±15．09△△联苯双酯 300mg 12 69．03 ±35．09* 60．65 ±20．55*雅解高 3．51g 13 86．30 ±22．99 72．31 ±16．42雅解低0．39g 13 114．58 ±33．88 78．15 ±27．15

2．6 “雅解沙把”对 ANIT致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST的影响:参考文献［8－10］方法，取昆明种清洁级小鼠84只，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组、茵栀黄组、雅解沙把高、低剂量组，每组动物14只。除正常组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水外，其余各组按分组分别灌胃给予相应药物，1次/d，连续用药8d。第6d给药1h后，除正常组外，其余5组均灌胃给予100mg/kgANIT橄榄油溶液，中毒后继续给药2d。第8d给药1h后(ANIT中毒48 h)摘眼球取血，分离血清，测定 ALT、Tbil。所有小鼠在ANIT中毒前和处死前分别禁食12 h，自由饮水。实验结果见表5，“雅解沙把”高剂量组小鼠血清ALT低于ANIT致肝损伤模型组 (P ＜0．05)。

表5 “雅解沙把”对ANIT致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、Tbil的影响(+s)

表5 “雅解沙把”对ANIT致急性肝损伤模型小鼠血清ALT、Tbil的影响(+s)

注:与正常组相比:△△P ＜0．01;与模型组相比:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

分组 剂量(/kg) 动物数(只) ALT(IU/L) Tbil(umol/L)正常20ml 14 8．97 ±3．20 4．67 ±3．21模型 20ml 13 80．24±17．45△△ 95．70±18．07△△联苯双酯 200mg 11 42．90±20．63＊＊ 81．76±10．76*茵栀黄 20ml 10 65．77 ±16．16* 80．69 ±12．92*雅解高 3．51g 12 64．55 ±19．18* 83．82 ±14．50雅解低0．39g 10 78．11 ±28．95 95．44 ±19．77

3 讨论

CCl4、D－Glan、AAP、TAA和ANIT损伤肝脏的机理不同。CCl4损伤肝脏的主要机理是CCl4经肝细胞色素P450代谢激活后生成三氯甲基(CCl3)自由基和氯自由基可引起细胞膜，脂质过氧化，导致肝细胞损伤坏死，胞浆内转氨酶渗入血液［6，11］。D－Glan损伤肝细胞是由于其与磷酸尿嘧啶核苷竞争性结合，导致糖原、RNA、蛋白质合成障碍，从而引起肝细胞炎症和坏死［6］。过量的AAP进入体内，经肝细胞色素P450代谢后，产生大量的半醌自由基，其需要谷胱甘肽(GSH)参与灭活，过多的自由基使肝内GSH被消耗，并与肝细胞蛋白质进行共价结合;且AAP在肝内代谢过程中产生的自由基，可引起肝细胞膜脂质过氧化，从而导致肝细胞损伤坏死［11，12］。TAA对肝脏造成损害，可能是由于TAA经肝细胞内细胞色素P450代谢后的产物与肝脏大分子物质结合，引起肝细胞结构和功能的改变继而坏死［13］。ANIT损伤肝细胞，不仅引起膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性、坏死。而且还直接损伤肝内胆管的内皮细胞，使之变性、肿胀、坏死，引起胆管阻塞，导致胆汁外溢，血中胆红素明显升高［14］。从本实验结果可以看出，“雅解沙把”对CCl4、D－Glan、AAP、TAA和ANIT所引起的小鼠急性肝损伤均具有一定的保肝降酶作用。此外，项目组前期实验研究发现，“雅解沙把”具有一定清除机体自由基的能力。综合分析“雅解沙把”对这5种化学性肝损伤的实验结果以及课题组前期研究结果，我们认为该药保肝作用的重要机理可能与其抑制脂质过氧化过程、增加机体清除自由基能力有关，还可能与其能调节肝细胞核酸、蛋白质、糖类等物质正常代谢有关。综上所述，我们认为“雅解沙把”并非仅仅作用于其中的某一种环节，而是对多种机制的多个环节都有影响，从而显示其多成分、多途径综合作用的优势。对于该方保护肝脏的具体作用机制的探讨有待于进一步深入研究。

［1］李仪奎．中药药理实验方法学［M］．上海:上海科学技术出版社．1991:459．

［2］田洪，潘善庆，陈子渊．急性肝损伤动物模型的建立［J］．中药药师，2009，12(4):449 －450．

［3］李梅，谷淑玲，马腾飞．D－氨基半乳糖致小鼠、大鼠肝损伤模型的实验性研究［J］．徐州医学院学报，2007，27(2):86－88．

［4］戴博，宋妍，王占一，等．高山红景天对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］．时珍国医国药，2007，18(6):1305 －1306．

［5］陈雪龙．实验性肝损伤动物模型的研究进展［J］．实验动物科学，2008，25(3):47 －59．

［6］祁雪，刘秀梅，陈晓光．鹿茸口服液对小鼠实验性肝损伤的保护作用［J］．中药药理与临床，2004，20(1):42 －43．

［7］钦传光，黄开勋，徐辉碧．泥鳅多糖对化学性肝损伤的保护作用［J］．中医药学报，2001，29(4):31 －32．

［8］巴根那，高玉峰，青玉．蒙药地格达－4味汤对小鼠化学性肝损伤的实验研究［J］．时珍国医国药，2009，20(12):3031－3033．

［9］杨新波，黄正明，曹文斌，等．CCL4，D—GaL，ANIT 致小鼠肝损伤模型的实验研究［J］．华人消化杂志，1998，6(1):19－20．

［10］于珊，徐雪钰，李昆峰，等．苯丙氨酸二肽类化合物Y101对α－萘异硫氰酸酯致小鼠肝损伤的保护作用［J］．解放军药学学报，2011，27(2):118 －121．

［11］徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学［M］．第3版．北京:人民卫生出版社，2002:1346－1347．

［12］宋正己，杨晋辉．实验性肝损伤模型的建立和研究进展［J］．医学综述，2004，10(5):278－280．

［13］魏新智，付勇强，王珲，等．硫代乙酰胺建立大鼠急性肝损伤模型探讨［J］．临床医学工程，2009，16(5):48 －49．

［14］黄正明，杨新波，曹文斌，等．化学性及免疫性肝损伤模型的方法学研究［J］．解放军药学学报，2005，21(1):42－46．