家蚕品种间及杂交后代超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力的探索研究

阮氏茉莉 林健荣

(1华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系，广东广州 510642; 2越南蚕桑丝研究中心，越南河内 10000)

生物体在代谢过程中会产生各种自由基，主要是超氧阴离子自由基(·O－2)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)等。这些自由基有很强的氧化能力，对许多生物功能分子有破坏作用。同时，生物体内存在超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)等清除自由基的酶类。在正常生理条件下，自由基不断产生，同时被不断清除，维持浓度极低的平衡状态。H2O2能使SOD失活，CAT和POD可清除H2O2，保护SOD;超氧阴离子自由基可使CAT和POD失活，SOD可清除超氧阴离子自由基，保护CAT和POD。这3种酶组成了相互保护清除自由基的系统，称为保护酶系统［1］。

SOD具有清除自由基，保护机体免遭伤害的功能。从生化角度探讨家蚕SOD的遗传性及其与经济性状的相关性，对育种工作具有重要的指导意义。陈田飞等［2］通过研究表明，SOD是生物体内抗氧化防御体系的重要酶类，精液用不同冷冻方式及不同冷冻时间冷藏SOD活性不同。魏国清等［3］研究发现，不同品种之间蚕卵SOD酶的活力相近。刘春等［4］研究表明，一代杂交种的活性值居双亲活性值中间。姜峰等［5］研究表明，家蚕5龄第4天血液中的CAT、CarE的活性均表现为雄蚕大于雌蚕，而SOD的活性则雌蚕大于雄蚕。

科研人员对CAT活性与家蚕经济性状相关性也进行了一些探索研究。陈萍等［6－7］研究了家蚕血液CAT的活性与育种中经济性状的相关性，结果表明:CAT活性与5龄历期、同宫茧率无关，与全龄期、死笼茧率、普通茧率呈一定的负相关，与全茧量、茧层量、茧层率呈不显著的正相关，与万头产茧量、万头茧层量呈正相关，而与虫蛹率、幼虫生命率呈显著正相关。吴小锋等［8］认为家蚕血液CAT活力与其发育变态、体内代谢均有密切的关系，逆境条件下CAT活力变化幅度的大小可以作为家蚕抗逆性强弱的一个重要生理指标。李群等［9］认为柞蚕丝腺CAT活性与生命力性状(包括收蚁结茧率)和产量性状(包括结茧数和茧层量)均呈显著正相关，而且与其杂种优势也呈显著的正相关关系;因此，丝腺CAT活性可作为一种生化指标用于预测柞蚕的杂种优势。本研究检测了亲本和F1代蚕卵的SOD、CAT活力，不同茧色蚕品种、不同性别的幼虫血、蛹血的CAT、SOD的活力变化，试验结果如下。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试蚕品种:原种是新九、黄白限(营白色茧的是雄、营黄色茧是雌)、大造(绿色茧)、沔赤(红色茧)，一代杂交种是新九×黄白限、黄白限×新九;所有品种均由华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系蚕种室保存提供。

主要试剂:K2HPO4、KH2PO4、NaCl、乙醇、磷酸、牛血清白蛋白为北京鼎国公司产品;SOD试剂盒、CAT试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。

1.2 试验方法

1.2.1 亲本和F1代蚕卵的SOD、CAT活力的测定

蚕卵蛋白的提取:分别取新九、黄白限、新九×黄白限、黄白限×新九的蚕卵0.15 g，置于研钵中，加入1.5 mL磷酸抽提缓冲液，冰浴研磨15 min，超声波处理3 min，4 ℃、10 000 r/min，离心 20 min，沉淀保存。上清液再经4℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液作为蚕卵可溶性总蛋白质的样品，分装，于－40℃冰箱保存备用。然后用Bradford法［10］测定各样品的蛋白含量，再分别按照CAT、SOD试剂盒说明书测定蚕卵SOD、CAT的活力。

1.2.2 不同茧色蚕品种的幼虫血、蛹血的CAT、SOD活力的测定 幼虫血的收集:于5龄第4天分别对黄白限(雌)、黄白限(雄)、大造、沔赤的幼虫各随机抽取5头蚕，剪去幼虫的腹足采血(加入少许苯基硫脲)，将幼虫的血液在4℃，15 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液置于－40℃冰箱内保存备用。

蛹血的收集:在蚕化蛹后的第5天，分别将黄白限(雌)、黄白限(雄)、大造、沔赤的蚕蛹置于冰浴条件下剪破蛹的翅部，将蚕蛹的血液滴入预加微量苯基硫脲的1.5 mL离心管中，于－40℃冰箱保存备用。

幼虫血、蛹血的SOD、CAT活力的测定:分别按照CAT、SOD试剂盒说明书，对提取的黄白限(雌)、黄白限(雄)、大造、沔赤的幼虫血、蛹血CAT、SOD的活力进行检测。

1.3 酶活力的计算公式

蚕卵CAT活力计算公式:

公式①中OD1为240 nm处零时吸光度，OD2为240 nm处1 min时吸光度，2.303为从自然对数换算成常用对数时的常数。CAT的酶活力单位定义:每克组织蛋白中CAT每秒钟分解吸光度为0.50～0.55的底物中的CAT相对量为1个CAT活力单位(U)。

蚕卵SOD活力计算公式:

公式②中SOD的酶活力单位定义:每毫克组织蛋白中抑制率表达50%时对应的SOD量记为1个SOD活力单位(U)。

蚕血、蛹血CAT的计算公式:

公式③中的271为斜率的倒数。H2O2的酶活力单位定义:每毫升样本将每秒钟分解1μmol的H2O2的量为1个活力单位(U)。

蚕血、蛹血总SOD活力计算公式:

酶活力单位定义:每毫升反应液中SOD抑制率为50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 亲本和F1代蚕卵蛋白的CAT活力

用磷酸缓冲液提取蚕卵蛋白，测定亲本和F1代的CAT活力，结果如图1所示。从图1可以看出，家蚕亲本新九、黄白限的CAT活力值分别是41.76、13.34 U/g。其中新九蚕卵蛋白的CAT活力值最高，与F1代新九×黄白限、黄白限×新九蚕卵蛋白的CAT活力值差异大。F1代新九×黄白限的CAT活力值最低(11.13 U/g)，低于双亲的CAT活力值。F1代黄白限×新九的CAT活力值为26.89 U/g，在双亲值之间。

图1 亲本和F1代蚕卵蛋白的CAT活力

2.2 亲本和F1代蚕卵蛋白的SOD活力

测定家蚕亲本、F1代蚕卵蛋白的SOD活力，结果如图2所示。从图2可以看出，家蚕亲本新九、黄白限蚕卵蛋白的SOD活力值分别为15.54 U/g和14.57 U/g。F1代正交新九×黄白限蚕卵蛋白的SOD活力值为15.26 U/g，F1代反交黄白限×新九蚕卵蛋白的SOD活力值为14.61 U/g，由此看来F1代蚕卵蛋白的SOD活力值是在双亲之间，即，新九＞新九×黄白限 ＞黄白限×新九＞黄白限，但亲本和F1代蚕卵蛋白的SOD活力值差异不大。

图2 亲本和F1代蚕卵蛋白的SOD活力

2.3 不同茧色蚕品种幼虫血、蛹血的CAT活力

测定家蚕不同茧色蚕品种的5龄第5天幼虫血和第5天蛹血的CAT活力，结果如图3所示。由图3可以看出，不同茧色蚕品种黄白限(雌，黄色茧)、黄白限(雄，白色茧)、大造(绿色茧)、沔赤(红色茧)的5龄第5天幼虫血的 CAT活力值分别为52.21、78.50、42.50、25.5 U/μL，第5 天蛹血的 CAT活力值分别为 77.75、104.97、60.60、54.50 U/μL。检测结果表明，不同茧色蚕品种间的5龄第5天幼虫血和第5天蛹血的CAT活力值相差较大;同一品种的5龄第5天蚕血和第5天蛹血的CAT活力也相差较大，第5天蛹血的CAT活力值明显高于5龄第5天幼虫血的CAT活力值;同一品种黄白限的雌雄间也有较大差异。

图3 不同茧色蚕品种幼虫血、蛹血的CAT活力

2.4 不同茧色蚕品种幼虫血、蛹血的SOD活力

测定家蚕不同茧色品种的5龄第5天幼虫血和第5天蛹血的SOD活力，结果如图4所示。从图4可以看出，SOD活力在不同茧色蚕品种的5龄第5天幼虫血中为黄白限(黄色茧)18.39 U/mL、黄白限(白色茧)29.15 U/mL、大造(绿色茧)20.01 U/mL、沔赤(红色茧)22.29 U/mL;SOD活力在不同茧色蚕品种第5天蛹血中为黄白限(黄色茧)21.02 U/mL、黄白限(白色茧)20.01 U/mL、大造(绿色茧)20.44 U/mL、沔赤(红色茧)20.72 U/mL。从图4还可以看出，SOD活力在不同茧色蚕品种间有差异，在雌雄间(黄白限品种)也有差异;同一品种的5龄第5天幼虫血与第5天蛹血的SOD活力虽有差异，但差别不大。

图4 不同蚕品种的蚕血、蛹血的SOD活力

3 小结与讨论

3.1 亲本和F1代蚕卵的SOD、CAT活力

本实验对亲本(新九、黄白限)和F1代(新九×黄白限、黄白限×新九)蚕卵的SOD、CAT活力检测与分析结果表明，一代杂交种蚕卵的SOD活力是在双亲之间，这与刘春等［4］的研究结果相一致。对蚕卵的CAT活力测定分析表明，一代杂交种的蚕卵CAT活力与亲本的蚕卵蛋白CAT活力有很大的差异，一代杂交种正交蚕卵的CAT活力低于双亲，而反交蚕卵的CAT活力在双亲之间。

3.2 不同茧色蚕品种幼虫血、蛹血的SOD和CAT活力

对不同茧色蚕品种［黄白限(雌，黄色茧)、黄白限(雄，白色茧)、大造(绿色茧)、沔赤(红色茧)］的5龄第5天幼虫血和第5天蛹血进行SOD活力检测的结果表明，在本测试的蚕品种中，不同茧色的蚕品种的5龄第5天幼虫血和第5天蛹血的SOD活力几乎差异不大，雌蛹血的SOD活力与雄蛹血的SOD活力差异也不大;同一品种的5龄第5天幼虫血与第5天蛹血的SOD活力虽有差异但差别不大。不同茧色蚕品种间的5龄第5天幼虫血和第5天蛹血的CAT活力值相差较大，第5天蛹血的CAT活力值明显高于5龄第5天幼虫血的CAT活力值，同一品种黄白限的雌雄间也有较大差别。

［1］Fridovich I.Oxygen is toxic［J］.Bioseince，1977，27(7):462 －466.

［2］陈田飞，吴大洋，李春峰.家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶(SOD)活性分析［J］.蚕学通讯，2004，24(4)，9 －14.

［3］魏国清，代君君，田恒杰，等.家蚕蚕卵超氧化物歧化酶初步研究［J］.安徽农业大学学报，2004，31(2):194 －196.

［4］刘春，罗英，代方银，等.家蚕超氧化物歧化酶(SOD)不同品种活性差异的研究［J］.蚕学通讯，2002，22(4):1 －6.

［5］姜峰，王磊，林健荣，等.雌雄家蚕血液中的保护酶差异研究［J］.广东农业科学，2006，(8)，74 －76.

［6］陈萍，朱勇，鲁成.家蚕血液超氧化物歧化酶遗传性及其与经济性状相关性研究［J］.蚕学通讯，1999，19(1):4 －8.

［7］陈萍，朱勇，鲁成.家蚕血液过氧化氢酶遗传性及其与经济性状相关性研究［J］.西南农业大学学报，1999，21(3):263－265.

［8］吴小锋，徐俊良，崔为正，等.家蚕血液过氧化氢酶活力及其与蚕体抗逆性的关系［J］.昆虫学报.1998，41(2):124－129.

［9］李群，刘彦群，马积彪，等.柞蚕过氧化氢酶活性与经济性状的相关性分析及杂种优势表现［J］.蚕业科学，2007，33(3):414－417.

［10］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Anal Biochem，1976，(72):248－254.