云蔗03-194甘蔗组培快繁技术

吴转娣，刘家勇，杨 昆，赵 俊，赵培方，吴才文，张 敏，姚 丽

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远 616600）

甘蔗糖业是云南边疆民族地区经济发展、蔗农脱贫致富的支柱产业。云南省蔗糖产业已经成为我省仅次于“两烟”的第二大生物资源产业，同时云南也是我国第二大糖料生产基地。选育和推广甘蔗新品种是提高我国甘蔗产量、降低蔗糖生产成本的重要手段[1－2]。目前，我国甘蔗旱坡地栽种面积已占植蔗面积的80%以上，迫切需要推广种植强宿根抗旱甘蔗新品种，以提高我国甘蔗单产，保证蔗糖产业的稳定可持续发展。2011年云南省农业科学院甘蔗研究所通过国家甘蔗品种鉴定，推出了云蔗03-194甘蔗新品种，其母本为新台糖25，父本为粤糖97-20，该品种从预备品比阶段就开始进行宿根性研究，田间综合表现为中大茎，叶片清秀，蔗茎均匀整齐，株形好，抗倒伏,脱叶好，宿根性强等优良性状。于2009—2010年推荐参加国家第七轮区域试验和生产试验。试验结果：云蔗03-194中早熟、高产高糖，抗旱性强，经受住了2009年云南百年不遇的特大干旱的考验，在2009—2011年云南持续特大干旱中表现突出，产量高、糖分高，抗倒伏和脱叶性好，被蔗农称为“两刀”甘蔗，收获时在蔗蔸和梢头砍两刀就可作为原料甘蔗交糖厂；经人工鉴定对黑穗病的抗性级别为1级，抗性反应型为抗病；人工胁迫抗旱性强。自然条件下未发现花叶病、梢腐病和黄叶综合症等病害。2010年底广西柳城遭遇强烈低温冻害过程中表现出了很强的抗寒性和宿根性。适合在云南、广西、广东、福建等蔗区肥力中等以上的蔗区种植，在燥热蔗区种植优势更为明显，具有很好的推广应用价值。本研究对云蔗03-194甘蔗品种进行组培快繁研究，旨在加快该甘蔗品种在全国推广应用的速度，为该品种健康种苗的生产提供技术基础[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

以云南省农业科学院甘蔗研究所内种植的甘蔗品种云蔗03-194为试验材料，取甘蔗茎顶部约60cm长，带回实验室后剥去部分老叶梢，即获得外植体。

1.2 外植体的处理和愈伤诱导

取甘蔗外植体，用75%酒精轻轻喷洗表面，放入超净工作台中，剥去外叶梢至见到甘蔗幼嫩叶片，置于灭菌纸上切成1mm薄片，接种于盛有培养基的培养皿中，每皿培养基上接种10片，用保鲜膜包边，置于暗培养箱中培养 15～20d，温度 28±2℃。 培养基配方为 MS+2,4-D 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L。观察记录实验结果。

1.3 分化诱导与增殖培养

将生长良好的愈伤组织随机接种于分化诱导培养基中，分化培养基以MS为基本培养基，为6-BA和KT 不同浓度的组合，共 12 个组合，即 MS+6-BA 1.0、2.0、3.0mg/L+KT 0.25、0.50、0.75、1.0 mg/L，每个组合中接种10瓶，每瓶接种10个。光照培养20～25d，光照14h，光照度为1500～2000lx，温度28±2℃。观察并记录芽分化的情况。

将分化培养获得的小苗转接到增殖培养基中，增殖培养基以MS为基本培养基，6-BA和KT不同浓度的组合，共 12 个组合，即 MS+6-BA 1.0、2.0、3.0mg/L+KT 0.50、0.75、1.0、1.25mg/L。将分化出来的甘蔗苗切小2～3株一丛，每个组合中接种10皿，每皿接种3～5丛。光照培养20～25d换1次培养基，增殖培养5次，光照14h，光照度为1500～2000lx，温度28±2℃。观察并记录芽分化的情况。

1.4 生根培养

增殖获得的甘蔗小苗转接到生根培养基中，生根培养基也是以MS为基本培养基，NAA和香蕉汁不同浓度组合，即 MS+NAA 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L+10、20、30、40mL/L 香蕉汁。 将一丛丛的甘蔗小苗切成单株，每个组合中接种10瓶，每瓶接种10株。光照培养20～25d，光照14h，光照度为1500～2000lx，温度28±2℃。观察并记录芽分化的情况。

在甘蔗愈伤的诱导、分化培养、增殖培养、生根培养的培养基中均加入3%蔗糖、0.4%琼脂，pH值为5.8。

1.5 甘蔗组培苗炼苗、假植及定植

组培苗生根后，将高6～10cm生根良好的小苗整瓶置于2500～3000lx自然散射光下炼苗4d，使其适应自然环境后打开瓶盖炼苗3d。将小苗假植于4种不同的移栽基质中，即河沙，红壤土，河沙：红壤土（2∶1），河沙∶红壤土（1∶2）待成活后出圃定植，小苗移植30d后观察结果。

2 实验结果

2.1 外植体的处理及愈伤生长情况

在晴天或雨后4h从田间取回甘蔗茎，外植体经75%酒精喷洗后，不需要用升汞消毒，直接剥去外叶梢就可获得无菌的甘蔗叶片外植体，污染率在1%～5%。如果出现污染，将其中部分好的愈伤换到新的培养基中，与升汞消毒相比操作方便，污染的机率也少，不会出现大量污染的情况。

2，4-D浓度对甘蔗愈伤的生长影响很大，当浓度较低时，愈伤的生长增重较慢，质地也比较硬；当浓度较高时，愈伤的长势好，但是愈伤的质量较差，活性不好，难以分化，甚至分化后出现变异。由表1可以看出3号培养基中的愈伤组织长势好，而且质量最好。因此，最适宜云蔗03-194甘蔗愈伤生长的培养基为MS+2,4-D 1.5mg/L。

?

2.2 愈伤分化诱导与增殖培养情况分析

根据表2的数据，可以看出云蔗03-194甘蔗愈伤在MS+6-BA 1.0mg/L+KT 0.50 mg/L的培养基中芽分化诱导率最高，6-BA和KT两者浓度较低时芽的分化速度较慢且生长较弱，而浓度较高时芽的分化受到抑制生长也细弱，叶片发黄。只有在两者浓度都比较适宜的时候才会长势好芽粗壮，叶色深绿。

分化培养基与增殖培养基相似，但是实验结果分析表明：从愈伤分化小苗的阶段需要的6-BA和KT的浓度较增殖培养基的要低一些。从表3中可知，最适宜云蔗03-194甘蔗小苗增殖的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L。在该培养基中增殖获得的甘蔗小苗长势好，叶深绿，苗粗壮。

实验结果还表明：在分化培养时用低浓度培养基 （6-BA 1.0mg/L+KT 0.50 mg/L）在增殖培养时用高浓度培养基 （6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L），组培获得的云蔗03-194甘蔗小苗变异少，苗的长势好、苗粗壮。

?

?

2.3 不同NAA浓度和香蕉汁添加量对甘蔗小苗生根的影响

从表4可以看出，培养基中不同NAA的浓度和香蕉汁添加量都能够启动云蔗03-194甘蔗的生根，生根率全部达到100%。但是，NAA始终是影响生根的重要因素，NAA的浓度对根的生长速度影响较大，当NAA的浓度在1.5 mg/L时根的诱导最快，根长。香蕉汁的作用主要是提供植株生长的营养物质，对生根没有诱导作用，当香蕉汁的添加量达到30mL/L时，可以很好地促进根长粗，使甘蔗植株生长健壮。因此，最适宜的生根培养基为MS+NAA 1.5 mg/L+30mL/L香蕉汁。

2.4 不同基质对组培苗假植成活率的影响

从表5可看出，云蔗03-194甘蔗在4种不同基质中小苗的成活率都较好，其中以沙∶红壤土（2∶1）的效果最好，成活率达到92%～96%，植株生长健壮，长势最好。

?

?

3 结论与讨论

甘蔗的组织培养有一定的特性，不同品种之间存在一定的差异，特别是在愈伤诱导方面，有些品种需要较高的2，4-D浓度，而有些品种愈伤在较低浓度时生长良好。在一些高要求的实验如甘蔗的转基因研究中部分甘蔗品种的愈伤诱导很难达到要求，因为在低浓度时愈伤生长慢，长势不好，质量不够好，而浓度高时，愈伤的生长过快，活性不好，变异率高。因此，愈伤诱导时2，4-D的浓度一定要控制好。通过进一步的实验我们证实云蔗03-194甘蔗在2，4-D浓度为1.5 mg/L时，生长最适宜。当外植体接种后出现严重褐化现象时，是因为甘蔗中的多酚类物质较高而引起的，这与品种有关。云蔗03-194甘蔗没有出现严重褐化的情况，因此不需要添加PVP，只需要加少量的活性碳就可以了。

有报道在甘蔗的诱导分化和增殖培养中使NAA与6-BA组合使用[4]，但实验表明，云蔗03-194在6-BA与KT组合使用时效果最好，增殖快，变异少，苗粗壮。在壮苗实验中香蕉汁和椰子汁都可取得良好的实验结果。目前，云蔗03-194甘蔗品种组培苗已移栽大田并已经在推广应用。

[1]陈跃.云南甘蔗产业发展情况[A].云南省第十二次甘蔗学术交流会论文集[C].2006:1-8.

[2]李奇伟，陈子云，梁洪.现代甘蔗改良技术[M].广州：华南理工大学出版社，2000：65.

[3]刘丽敏，李松，戴友铭，余坤兴，刘红坚，淡明.甘蔗茎尖脱毒培养技术研究[J].中国糖料，2009（2）：18-20.

[4]何洪良，唐君海，蓝庆江，等.甘蔗新品系桂糖02-901的离体快繁技术[J].农业研究与应用，2011，133（2）：62-63.