A蛋白间接酶联免疫法对杂交竹梢枯病菌蛋白毒素的检测

朱天辉，李姝江，韩 珊，谯天敏

(四川农业大学林学院，四川 雅安 625014)

撑×绿杂交竹是以撑蒿竹为母本(Bambusa pervaiabilis Mc-Clure)，大绿竹(Dendrocalamopsis daii Keng f.)为父本，通过人工授粉，经过多年研究而培育筛选出的新竹种，1993年被列为林业部(局)100项重点成果推广之一。南方地区已大量栽培，特别在长江中上游地区生态建设中，四川于1999年从广西大规模引种该竹以满足造纸业和退耕还林的需求。但近年来杂交竹出现大面积枯死，造成巨大经济损失，极大地威胁着长江中上游地区退耕还林的进程和生态屏障的建设，目前已证实导致杂交竹枯死的病原为暗孢节菱孢菌［Arthrinium phaeospermum(Corda)M.B.Ellis］［1］，其产生的毒素是病害发生的主要致病因子，该毒素由蛋白类［2］和非蛋类［3］物质组成，其毒理作用作者已进行了深入探索，但对毒素物质的快速检测尚无研究。本文在纯化杂交竹梢枯病菌蛋白毒素基础上，用A蛋白双抗夹心法对其进行标记试验，为该毒素结合位点研究提供检验技术。

1 材料与方法

1.1 材料

病株汁液:发病杂交竹榨取液。

毒素发酵液:以改进Fries为基础培养基，定量接种在PDA平板上培养的暗孢节菱孢菌丝块(5 mm·100 mL－1)，26 °C，140 r·min－1震荡培养 15 d，双层纱布过滤后，取其滤液备用。

毒素蛋白及其抗血清:上述毒素发酵液经旋转蒸发仪(40℃)浓缩、硫酸铵分级沉淀［4］，结合低压层析分离系统［5］和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳［6］方法纯化获得纯蛋白组分(毒素)，采用常规方法免疫新西兰大白兔［7］，即经两次基础免疫［背部皮下、皮内多点注射2 mL乳剂(含0.5 mL 30 μg·mL－1Ap-毒素蛋白)］和3次强化免疫(静脉注射，用量同基础免疫)后，颈动脉采血，获得毒素的抗血清。玻管环状沉淀测定其效价为1∶640。

1.2 酶联免疫检测

采用陈永萱［8］的A蛋白双抗体夹心方法。试验在微量测定板的小孔内进行:(1)用0.05 mol·L－1pH 9.6的碳酸盐缓冲液配制的A蛋白溶液预包被。每孔200 μL，处理2小时。(2)以0.05%的Tween20磷酸盐缓冲液(0.01 mg·L－1pH7.0 PBST)稀释的抗血清包被小孔，每孔加100 μL，处理1 h。(3)加测定样本(杂交竹梢枯病株汁液、纯蛋白毒素、毒素发酵液)，以PBST稀释，每孔加100 μL处理2 h。(4)加测定血清，以PBST稀释，每孔100 μL，处理2 h。(5)加辣根过氧化物酶标记的葡萄球A蛋白(HRP-Protein A是上海生物制品研究所产品)。HRP-Protein A同样以PBST稀释，每孔加100 μL，处理1 h。(6)加底物 TMB显色30 min。底物以22.2 mL的0.1 mol·L－1柠檬加27.8 mL的0.2 mol·L－1磷酸氢二钠加蒸馏水至100 mL的缓冲液稀释，每孔100 μL。(7)以2 M的H2SO4终止反应，每孔加50 μL。然后在酶标免疫检测仪上(A450 nm)记录读数。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel和LSD多重差异比较(p＜0.05)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 A蛋白预包被对检测效果的影响

表1表明A蛋白预包被能影响ELISA测定结果，A蛋白预包被不仅能提高测定的效价特别是在测定抗血清稀释度较高的情况下更为显著，而且也能明显降低无蛋白毒素对照本底值。凡不加A蛋白预包被时的本底值在0.40～0.42之间，而加A蛋白预包被的本底值却降到0.07～0.08，与缓冲液作对照的数值接近。A蛋白预包被适宜浓度的测定是将 A 蛋白从 10 μg·mL－1稀释至 0.001 μg·mL－1分别预包被微量测定板，对暗孢节菱孢发酵液进行测定。测定的OD值随A蛋白的稀释而有下降趋势，但在测定的A蛋白预包被的浓度范围内没有显著影响，说明A蛋白预包被可以在很微量的浓度下进行测定，即使稀释到0.001 μg·mL－1仍有较好的检测效果。

2.2 抗原(纯毒素和发酵液、病株汁液)浓度对酶联检测的作用

将纯毒素蛋白经10倍系列稀释至10－10后进行灵敏度和特异性测定显示(表2)，提纯毒素在稀释倍数小于10－4时，检测结果显著，而当稀释倍数大于10－6，检测结果与对照接近，不适宜进行测定。

表1 A蛋白预包被对检测效果的影响(OD450吸收值)Table 1 Effect of protein's pre-coating on the detection(OD450absorption)

表2 纯毒素蛋白浓度对检测的影响Table 2 Effect of the concentration of purified toxic protein on the detection

将含毒素发酵液和病株汁液稀释不同倍数在相同条件下检测，两种含毒素材料测定趋势相似，OD值随抗原稀释倍数的增加下降，且下降幅度受测定抗血清浓度的影响(表3和表4)。如测定抗血清浓度为10－3时，病株汁液稀释到100倍时就不能进行测定比较，而测定抗血清浓度为10－2时，病株汁液稀释至1000倍以上时才不能检测。

表3 发酵液浓度对检测的影响Table 3 Effect of the concentration of fermentation liquid on the detection

表4 病株汁液浓度对检测的影响Table 4 Effect of the concentration of the juice of diseased plant on the detection

2.3 抗血清浓度对测定结果的影响

在相同测定条件下比较，含毒素发酵液和病株汁液检测结果趋势相似，OD值随测定抗血清浓度降低而下降，同时，抗原浓度对检测结果也有较大影响(表5和表6)。两种被检测液稀释1∶100倍，10－3的测定抗血清浓度的OD值与健株差异不明显，当检测液稀释1∶5(1∶50时，测定抗血清浓度在10－4(病株汁液)和10－6(含毒素发酵液)时可测出显著差别。

2.4 标记A蛋白浓度对检测结果的影响

结果表明(表7)，标记A蛋白浓度对检测有显著影响，OD值随酶标记A蛋白浓度而下降，抗血清浓度为10－4下，含毒素发酵液在标记A蛋白浓度为1∶10(1∶640范围内有较好测定结果，而病株汁液在标记A蛋白浓度为1∶10(1∶160才能测出。

表5 抗血清与毒素发酵液稀释度的关系Table 5 Relationship between antiserum and dilution multiple of toxic fermentation liquid

表6 抗血清与病株汁液稀释度的关系Table 6 Relationship between antiserum and dilution multiple of diseased plant juice

表7 酶标记A蛋白浓度对检波灵敏度的影响Table 7 Effect of protein A on demodulation sensitivity

3 讨论

杂交竹梢枯病是四川近年来新发现的重大毁灭性病害，发病迅速，防治难度大，如不早期发现，很难控制。A蛋白间接酶联免疫吸附法检测杂交竹梢枯病菌毒素蛋白是在双抗体夹心直接免疫吸附法［8］基础上进行的，后者已广泛应用于植物病毒的检测工作，本研究首次将此技术用于真菌毒素检测中，该方法对杂交竹病株汁液中的致病毒素有高度的特异性和灵敏度，能早期诊断暗孢节菱孢引起的杂交竹梢枯病，对杂交竹养护有重要意义。

A蛋白预包被对本底值下降和非特异性反应的消除有明显作用，可大大提高测定效价;在测定中，预包被的A蛋白只需要很微的量，测定抗血清的浓度对包被抗血清的浓度对测定结果的影响更为重要，提高抗血清的效价进而提高测定的灵敏度。

［1］朱天辉，黄宗超.撑×绿杂交竹梢枯病病原及发生规律研究［J］.中国森林病虫，2009，28(3):10 ～12.

［2］朱天辉，李姝江，车冠男.暗孢节菱孢菌蛋白类毒素产毒条件研究［J］.四川农业大学学报，2011，29(4):518 ～523.

［3］李姝江，朱天辉，杨莉，等.暗孢节菱孢菌非蛋白类毒素对杂交竹生理代谢的影响［J］.植物病理学报，2011，41(6):587～595.

［4］曹煜成，李卓佳，吴灶和，等.地衣芽孢杆菌胞外蛋白酶的纯化及特性分析［J］.水生生物学报，2006，30(3):262 －268.

［5］吴士良.生物化学与分子生物学实验教程［M］.北京:科学出版社，2004:20 ～24.

［6］汪家政，范明.蛋白质技术手册［M］.北京:科学出版社，2001:77～100.

［7］陈兰明，陈永萱.黄曲霉毒素B_1间接竞争抑制ELISA定量分析法的建立和应用［J］.南京农业大学学报，1998，21(2):65～72.

［8］陈永萱，薛宝娣，刘凤权.A蛋白间接酶联免疫吸附法检测二种西瓜花叶病毒(WMV－2和CMV)的研究［J］.病毒学杂志，1988，(4):357 ～362.