替普瑞酮对萎缩性胃炎大鼠胃黏膜p16、TGF-β1表达的影响

张红珠 张 琪 张翠萍 孙向红 王辉明

青岛大学医学院附属医院消化科(266003)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一种胃癌癌前状态，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染与CAG和胃癌，尤其是肠型胃癌的发生密切相关［1］，预防和阻止CAG向胃癌进展是一个重要临床问题。CAG经肠化生、异型增生向胃癌演变的过程中有多种因素参与，包括癌基因激活、抑癌基因失活、细胞周期调节因子调控异常、免疫调节异常等。本实验以Hp相关CAG大鼠模型为研究对象，通过观察黏膜保护剂替普瑞酮对模型动物CAG发生、发展过程中肿瘤抑制基因p16和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响，探讨替普瑞酮对CAG的防治作用。

材料与方法

一、实验动物、菌株和药物

健康雄性清洁级 Wistar大鼠70只，体质量150～200 g，由山东鲁抗医药股份有限公司质监中心提供(许可证号:SCXK鲁20080002)。Hp SS1菌株由江苏省人民医院潘晓林博士惠赠。替普瑞酮［卫材(中国)药业有限公司，商品名:施维舒，50 mg/粒，国药准字:J20030052，批号:101105A］、阿莫西林(山东淄博新达制药有限公司，商品名:新达贝宁，250 mg/粒，国药准字:H37020470，批号:110840)、吲哚美辛(临汾奇林药业有限公司，25 mg/片，国药准字:H14020549，批号:1010031)分别与蒸馏水以 5∶1、17.5∶1、0.9∶1 的质量比例配制成溶液。

二、方法

1.动物分组和CAG模型制备:70只大鼠随机分为正常对照组(n=20)、CAG模型组(n=25)和替普瑞酮干预组(n=25)。Hp悬液和CAG模型的制备参考既往文献并加以改进［2～4］。CAG模型组和替普瑞酮干预组先序贯予阿莫西林175 mg/kg(1周)和吲哚美辛9 mg/kg(5 d)灌胃预处理，再予Hp悬液(1×1012cfu/L)灌胃，每次1.5 mL，隔日一次，共6次。灌胃前后分别禁食12 h和4 h。间隔2周后以60%(v/v)乙醇溶液 与20 g/L水杨酸钠溶液按50∶1的体积比例配制灌胃，每次1 ml/100 g，每日一次，共26周。正常对照组仅以0.9%NaCl溶液灌胃，每次1 ml/100 g，每日一次，共26周。除规定禁食时间外，所有大鼠均自由进食、饮水。

2.替普瑞酮干预:替普瑞酮干预组于乙醇-水杨酸钠溶液灌胃后5 h以50 mg/kg替普瑞酮灌胃，两次灌胃间禁食、禁水，共干预26周。

3.一般情况观察:实验过程中观察并记录各组大鼠一般情况，每周测量体质量，根据体质量变化调整药物剂量。

4.标本获取和组织病理学检查:最后一次灌胃结束后禁食24 h，颈椎离断法处死大鼠。剪开腹腔，取出全胃，沿大弯侧剪开，以0.9%NaCl溶液冲洗干净，观察胃黏膜大体形态(黏膜色泽、光滑度、有无损伤以及胃体、胃窦厚度)。标本以4%甲醛溶液固定24 h，沿大弯侧横向取材，包括胃体和胃窦，宽约4 mm，脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色。光学显微镜下观察胃黏膜组织学表现。

5.免疫组化染色:采用非生物素即用型二步法。鼠p16单克隆抗体、小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂、兔TGF-β1多克隆抗体、兔二步法免疫组化检测试剂、DAB试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。具体操作步骤参照试剂说明书。

p16、TGF-β1免疫阳性物质呈棕黄色或棕黑色。于光学显微镜下随机选取15个高倍视野(×400)，每视野计数200个细胞，计算阳性细胞百分率，取均值。阳性细胞百分率≥10%为阳性，＜10%为阴性。

三、统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般情况

正常对照组大鼠皮毛白亮光滑，两眼有神，活动敏捷，食量大，实验过程中体质量呈上升趋势，粪便呈黑色颗粒状，无便溏现象。CAG模型组大鼠皮毛发黄，无光泽，两眼无神，动作迟缓，拱背，聚集成堆，食量小，起初体质量缓慢上升，第15周后逐渐下降，有便溏现象，四肢和尾部略苍白。替普瑞酮干预组大鼠皮毛略发黄，两眼有神，活动较敏捷，食量可，体质量明显高于同时点CAG模型组，接近正常对照组，起初有便溏现象，药物干预21 d后症状逐渐缓解。CAG模型组第3周、第12周、第15周各有1只大鼠死亡，死亡原因考虑分别与灌胃后呛咳、窒息、肺部感染可能和肠道巨大脓肿所致的肠梗阻有关;替普瑞酮干预组第2周有2只大鼠死亡，死因为灌胃后呛咳、窒息。图1为三组大鼠实验期间体质量变化情况。

图1 各组大鼠体质量变化

二、组织病理学表现

1.肉眼观察:正常对照组胃黏膜呈红色，表面光滑，无颗粒感，厚度约2 mm。CAG模型组大鼠多有胃肠动力障碍，禁食24 h后胃内仍有残留食物;胃黏膜以白色为主，多数出现糜烂和陈旧性出血点，以胃窦部为主，黏膜变薄。替普瑞酮干预组胃黏膜红润光滑，无出血、糜烂，胃窦部黏膜较正常对照组略变薄(见图2)。

2.光学显微镜观察:正常对照组胃黏膜腺体排列规整，偶可见炎性细胞浸润。CAG模型组胃黏膜变薄，腺体间隙较大，排列不规整，腺体出现萎缩，细胞数目减少。替普瑞酮干预组胃黏膜较CAG模型组增厚，腺体排列规整，腺体数目较CAG模型组增多(见图3)。

三、胃黏膜 p16、TGF-β1 蛋白表达

p16阳性表达主要定位于细胞核(见图4)。正常对照组、CAG模型组、替普瑞酮干预组胃黏膜p16阳性表达率分别为 95.0%(19/20)、36.4%(8/22)、73.9%(17/23)，正常对照组和替普瑞酮干预组显著高于 CAG 模型组(χ2=15.688，P=0.000;χ2=6.421，P=0.011)，但正常对照组与替普瑞酮干预组间差异无统计学意义(χ2=2.114，P=0.146)。

TGF-β1阳性表达主要定位于细胞质(见图4)。正常组对照、CAG模型组、替普瑞酮干预组胃黏膜TGF-β1 阳性表达率分别为 10.0%(2/20)、81.8%(18/22)、30.4%(7/23)，正常对照组和替普瑞酮干预组显著低于CAG 模型组(χ2=21.663，P=0.000;χ2=12.024，P=0.001)，但正常对照组与替普瑞酮干预组间差异无统计学意义(χ2=2.699，P=0.100)。

图2 各组大鼠胃黏膜大体形态

图3 各组大鼠胃黏膜组织学表现(HE染色)

图4 各组大鼠胃黏膜p16、TGF-β1蛋白表达(免疫组化染色，×200)

讨 论

替普瑞酮是一种具备良好理化特性的黏膜保护剂，可促进胃黏膜、胃黏液中主要再生防御因子、高分子糖蛋白、磷脂的合成和分泌，提高胃黏液中的碳酸氢盐含量，改善受损胃黏膜增生区细胞的增殖能力，增加胃黏膜中前列腺素的生物合成，改善胃黏膜血流，对急、慢性胃炎和胃溃疡具有良好疗效。研究证实替普瑞酮可有效预防非甾体消炎药(NSAIDs)相关胃黏膜损伤［5，6］;并可通过促进胃黏膜热休克蛋白70(HSP70)表达参与胃黏膜修复［7］。有临床治疗中，替普瑞酮能明显改善CAG患者的临床、内镜和组织学表现，患者胃黏膜炎症、活动性、腺体数目减少、肠化生和异型增生评分均较治疗前显著降低［8］;还能增加慢性非萎缩性胃炎患者的胃黏膜氨基己糖(反映黏蛋白分泌情况)含量，并有效抑制Hp［9］。本研究显示替普瑞酮干预可明显改善CAG模型大鼠的一般情况以及胃黏膜大体形态和组织学表现，模型大鼠胃黏膜增厚，腺体数目增多，无出血、糜烂，表明其能修复胃黏膜损伤，且对胃黏膜萎缩有部分逆转作用。

p16为公认的肿瘤抑制基因，定位于人类染色体9p21，多数恶性肿瘤存在p16基因缺失或突变。p16基因编码蛋白是一种细胞周期调节蛋白，可与cyclin D竞争性结合细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4/6，阻止细胞从G1期进入S期，从而对有丝分裂进行负反馈调节，发挥抑癌作用。p16基因缺失、突变或启动子区甲基化所致的基因功能缺失及其蛋白表达异常参与了恶性肿瘤的发生。现已发现p16基因改变，尤其是基因缺失与肿瘤进展和转移显著相关［10，11］。既往研究［12～14］显示，在大鼠CAG的发生、发展过程中，从正常胃黏膜至萎缩、肠化生和异型增生，p16蛋白表达逐渐降低。本实验中CAG模型大鼠胃黏膜p16蛋白阳性表达率显著低于正常大鼠，而接受替普瑞酮干预的模型大鼠p16蛋白阳性表达率较未接受干预者显著增高，与正常大鼠相比差异无统计学意义，证实p16基因功能缺失和蛋白表达异常参与了CAG的发生、发展，而替普瑞酮干预可通过恢复p16的表达和功能阻止CAG进一步发展。

TGF-β是一类具有多种生物学功能的细胞因子家族，哺乳动物中有 TGF-β1、β2、β3三种亚型表达，其中以TGF-β1含量最高，具有代表性。TGF-β1通过与细胞膜上的TGF-β受体结合，调节细胞增殖、分化和形态形成，在血管生成、损伤修复、免疫抑制、细胞外基质形成、纤维化和肿瘤发生中亦发挥重要作用。肿瘤细胞分泌的TGF-β1可促进初始T细胞向具有免疫抑制作用的调节性T细胞分化，通过抑制宿主免疫系统，使肿瘤逃避机体的免疫监视，从而促进肿瘤发生、侵袭和转移［15，16］。研究发现从正常胃黏膜、慢性非萎缩性胃炎、CAG、肠化生/异型增生至胃癌，胃黏膜TGF-β1蛋白表达随黏膜病变的加重而逐渐增高［15，17］，同时机体细胞免疫功能逐渐降低［15］。本实验中CAG模型大鼠胃黏膜TGF-β1蛋白阳性表达率显著高于正常大鼠，与既往研究结果一致，证实TGF-β1参与了正常胃黏膜由胃癌癌前状态逐步进展至胃癌的演变过程;而接受替普瑞酮干预的模型大鼠TGF-β1蛋白阳性表达率较未接受干预者显著降低，与正常大鼠相比差异无统计学意义，表明普瑞酮干预可能通过下调TGF-β1表达抑制CAG的发生、发展。

综上所述，在大鼠正常胃黏膜向CAG转变的过程中，胃黏膜 p16蛋白阳性表达率呈下降趋势，TGF-β1蛋白阳性表达率呈上升趋势。造模期间给予替普瑞酮干预能修复胃黏膜损伤，部分逆转胃黏膜萎缩，阻止CAG的发生、发展，其机制可能部分与恢复p16表达和功能以及下调TGF-β1表达有关。上述发现为应用黏膜保护剂替普瑞酮治疗CAG并阻止其癌变提供了实验依据。

1 Correa P，Piazuelo MB.Helicobacter pylori infection and gastric adenocarcinoma［J］.US Gastroenterol Hepatol Rev，2011，7(1):59-64.

2 张琳，姚冬梅，姚希贤，等.大鼠Hp相关性慢性胃炎模型的制做［J］.中国比较医学杂志，2004，14(3):161-165.

3 刘翔，卢放根.SPF级BALB/c小鼠感染幽门螺杆菌的造模方法研究［J］.临床和实验医学杂志，2007，6(7):3-5.

4 唐旭东，张翠萍，张琪，等.改良式Hp感染萎缩性胃炎大鼠模型的建立［J］.青岛大学医学院学报，2012，48(3):247-249，252.

5 马娟，元刚，陈旻湖.非甾体类消炎药对胃黏膜的损伤及替普瑞酮预防作用的实验研究［J］.中华医学杂志，2006，86(40):2868-2873.

6 Ushijima H，Tanaka K，Takeda M，et al.Geranylgeranylacetone protects membranes against nonsteroidal antiinflammatory drugs［J］.Mol Pharmacol，2005，68(4):1156-1161.

7 刘玮丽，姒健敏，孙柯科.胃黏膜保护剂替普瑞酮对慢性萎缩性胃炎大鼠热休克蛋白表达的影响［J］.中国药学杂志，2005，40(20):1549-1553.

8 张翠萍，孙学国，赵清喜，等.替普瑞酮治疗慢性萎缩性胃炎100例［J］.世界华人消化杂志，2008，16(10):1069-1073.

9 董秀云，叶嗣懋，林三仁，等.替普瑞酮对幽门螺杆菌和氨基己糖作用的临床研究［J］.北京医科大学学报，1997，29(5):443-445.

10 Ignatov A，Bischoff J，Schwarzenau C，et al.P16 alterations increase the metastatic potential of endometrial carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2008，111(2):365-371.

11 Günther T，Schneider-Stock R，Pross M，et al.Alterations of the p16/MTS1-tumor suppressor gene in gastric cancer［J］.Pathol Res Pract，1998，194(12):809-813.

12 姒健敏，王良静，陈淑洁，等.鼠慢性萎缩性胃炎胃黏膜形态特征和细胞增殖调控因子变化研究［J］.中华消化杂志，2004，24(8):476-479.

13 王卓才，黄小让，马建青，等.疏肝养胃通脉冲剂治疗慢性萎缩性胃炎后胃黏膜P16，P53和Rb蛋白表达的观察［J］.山西医药杂志，2008，37(10):867-869.

14 陈海金，王惠吉.大鼠胃黏膜萎缩过程中的组织学变化和p16、Bcl-2、增殖细胞核抗原表达［J］.胃肠病学，2008，13(1):22-26.

15 李红平，赵逵，毛万姮，等.胃黏膜TGF-β1在幽门螺杆菌感染中的表达及与外周血T细胞亚群变化的关系［J］.世界华人消化杂志，2010，18(5):506-511.

16 孟欣颖，马健，江晨，等.胃癌组织中IL-17、IL-6和TGF-β1的表达及其临床意义［J］.胃肠病学，2011，16(10):593-596.

17 张川，江佛湖，戴强，等.胃癌及其癌前病变中转化生长因子β1、细胞周期蛋白A表达与细胞凋亡关系的研究［J］.胃肠病学，2001，6(2):97-99，106.