七氟醚预处理对LPS诱导的小鼠心功能障碍的影响*

李健玲， 朱小青， 李学敏， 李红梅， 王彦平， 王 媛， 戚仁斌△， 李雅兰△

(暨南大学1附属第一医院麻醉科，2医学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理实验室，广东广州 510632)

七氟醚预处理对LPS诱导的小鼠心功能障碍的影响*

李健玲1， 朱小青2， 李学敏2， 李红梅2， 王彦平2， 王 媛2， 戚仁斌2△， 李雅兰1△

(暨南大学1附属第一医院麻醉科，2医学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理实验室，广东广州 510632)

目的:观察七氟醚(Sevo)预处理对脂多糖(LPS)诱导的心功能障碍的影响并初步探讨其作用机制。方法:40只雄性BALB/c小鼠随机分为4组:对照组(control)、LPS组、Sevo组和Sevo+LPS组。分别用2% Sevo(以纯氧为载气)或纯氧预处理30 min，洗脱10 min后，腹腔注射LPS 18 mg/kg或等量生理盐水。于腹腔注射后12 h，通过高分辨小动物超声系统检测心功能，结束后立即采血并处死小鼠，用生化分析仪检测血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK－MB)活性;留取小鼠心脏标本，制备石蜡切片，进行HE染色后在光学显微镜上观察各组小鼠心脏的组织结构变化，分别用硝酸还原酶法和比色法检测小鼠心肌组织中一氧化氮(NO)的含量和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。结果:LPS腹腔注射后12 h，超声检测显示LPS组小鼠左心室舒张末期容积(LVEDV)增大(P＜0.05)，每搏输出量(SV)、心输出量(CO)和射血分数(EF)降低(P＜0.05);血清LDH和CKMB水平升高(P＜0.05);病理切片见心肌明显病变。Sevo+LPS组与LPS组比较，LVEDV减小(P＜0.05)，SV、CO和EF增加(P＜0.05)，LDH和CK－MB水平显著降低(P＜0.05)，心肌组织的病理损伤减轻。LPS引起心肌组织中NO含量和iNOS活性升高(P＜0.05)，Sevo对此有抑制作用(P＜0.05)。结论:Sevo预处理减轻LPS引起的心肌损伤和心功能障碍，其机制可能与其抑制心肌iNOS活性，减少NO的生成有关。

七氟醚;预处理;脂多糖类;心肌保护;一氧化氮合酶;一氧化氮

临床上约有25%～30% 的脓毒症是由G－菌感染引起的，其细胞壁的主要成分内毒素(endotoxin)或脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，由脂质A、核心寡糖和O－特异性侧链组成，是脓毒症性休克的主要致病因子［1］。心功能障碍是脓毒症休克患者常见的并发症之一，有报道称心功能障碍的发生，特别是内毒素引起的，可使脓毒症休克的死亡率从20%增加到70%～90%［2］。因此，改善心脏功能对于脓毒症病人的生存具有重要作用。

严重创伤合并感染的患者(如脓毒症)往往需要手术治疗，所以麻醉剂的选择对病人的术中安全和预后康复有重要的影响。美国心脏病学会2007年发布的指南中推荐使用卤族类吸入麻醉药以保护心肌［3］，七氟醚(sevoflurane，Sevo)是90年代上市的一种新型吸入麻醉剂，具有诱导和苏醒迅速、术中维持平稳等优点，目前在临床上应用广泛［4］。已有大量的临床研究证实，七氟醚对缺血的心肌有保护作用，如De Hert等［5］研究发现冠状动脉搭桥术(coronary artery bypass grafting，CABG)中使用七氟醚，可使术后循环更稳定。我们先前研究［6］采用手术结扎大鼠左冠状动脉前降支模型，也证实七氟醚在缺血再灌注损伤中具有心肌保护作用。然而，七氟醚对内毒素损伤的心肌是否也具有保护作用?如果有保护作用，是否与在心血管调节中有重要作用的一氧化氮(nitric oxide，NO)系统有关?目前则鲜见报道。因此，本实验拟采用小鼠LPS腹腔注射复制内毒素血症模型，观察七氟醚预处理对内毒素诱导的心功能障碍的影响，并对其与NO及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的关系作初步探讨。

材料和方法

1 材料

LPS(大肠杆菌O55∶B5)购自Sigma，Sevo购自Abbott，NO检测试剂盒(硝酸还原酶法)、iNOS检测试剂盒(比色法)购自南京建成生物工程研究所，蛋白定量测定试剂盒(BCA法)购自上海申能博彩生物公司;主要实验仪器包括 WATO Ex－20呼吸机(Mindray，中国)，Bx40型光学显微镜(Olympus)，VisualSonies®Vevo770TM高分辨小动物超声系统(Visual Sonics)，7600－020型全自动生化分析仪(Hitachi)，Tecan safire全波长多功能酶标仪(Tecan)。

2 方法

2.1 实验分组 SPF级雄性BALB/c小鼠40只，6～8周龄，体重23～25 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2008－0002，自然昼夜周期和自由饮水进食条件下分笼饲养。实验前置于实验环境中适应1周，实验环境温度控制在(24± 2)℃，相对湿度为60%～80%。所有小鼠随机分为4组:对照组(control)、LPS组、Sevo组和七氟醚处理组(Sevo+LPS)。LPS组和control组给予100%纯氧30 min，洗脱10 min，分别腹腔注射18 mg/kg LPS(0.2 mL/10 g)和等量生理盐水(0.2 mL/10 g);Sevo+ LPS组和Sevo组用100%纯氧作为载气给予2%七氟醚预处理30 min，洗脱10 min，分别腹腔注射LPS和生理盐水。

2.2 心功能的检测 于腹腔注射后12 h，小鼠称重，用0.67%戊巴比妥钠(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，使小鼠保持适当的麻醉状态，保持自主呼吸，放置于37℃的恒温垫上，通过导电膏将小鼠四肢末端与4个电极相连接并用胶布固定。在小鼠胸前区涂抹超声偶合剂，运用RMV707B型高频超声探头(探头频率设置为30 MHz，探测深度为10～15 mm)对小鼠进行超声心动图检查，探头置于其左胸，实时采集胸骨旁左心室短轴M型超声心动图像。连续采集10个心动周期的动态图像，记录的M超的扫描速度为800 mm/s，储存图像后进行脱机分析。利用VisualSonies®Vevo770TM高分辨率小动物超声系统软件，在所采集图像上对数据进行处理和分析，测得各组小鼠心率(heart rate，HR)、每搏输出量(stroke volume，SV)、心输出量(cardiac output，CO)、左心室舒张末期容积(left ventricular end－diastolic volume，LVEDV)和射血分数(ejection fraction，EF)。所有数据及计算值均根据美国超声心动图协会(ASE)推荐方法，每组原始数据取连续3个心动周期的平均值，超声检查的操作及分析均由专业人员完成。

2.3 血清心肌酶的测定 各组小鼠于超声心功能检测完毕后，立即去眼球取血0.8 mL，室温静置2 h，5 000 r/min离心15 min，取上清，全自动生化仪测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)含量。

2.4 HE染色观察心肌组织结构 各组小鼠采血后立即处死，打开胸腔，分离心脏，取心尖部组织，迅速置入4%甲醛溶液中固定，常规方法制成石蜡切片，HE染色，在光学显微镜下观察心脏组织结构的改变，并拍摄照片。由同一个实验者在光镜下观察组织学特征后给出病理报告。

2.5 心肌组织NO含量及iNOS活性的测定 冷生理盐水浸洗并轻微挤压心脏，将心腔残留的血液排出，然后用滤纸吸干液体。将心脏置于匀浆器中，以1∶10质量体积比加入生理盐水，在冰面上充分匀浆，所得匀浆液4℃、3 000 r/min离心10 min，收集上清分装，－20℃保存，BCA法测定心肌组织匀浆蛋白含量。然后，按试剂盒说明书的操作步骤采用硝酸还原酶法检测其NO含量(μmol/g protein)，进一步采用比色法检测iNOS活性(U/g protein)。

3 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料采用均数±标准误(珋x±sE)表示，多组间比较用单因素方差分析(One－way ANOVA)，各组方差齐时，两两比较采用LSD法;各组方差不齐时，两两比较用Tamhane＇s T2法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 心功能检测结果

各组小鼠HR无显著差异。与对照组相比，LPS组小鼠LVEDV增大(P＜0.05)，SV、CO和EF显著降低(P＜0.05)。而Sevo+LPS组与LPS组比较，LVEDV减小(P＜0.05)，SV、CO和EF增加(P＜0.05)，见图1、表1，提示七氟醚预处理可使心功能在一定程度上得到改善。

2 血清心肌酶的检测结果

表2显示，对照组与Sevo组之间血清LDH和CK－MB水平无显著差异(P＞0.05);LPS腹腔注射后12 h，小鼠血清LDH和CK－MB含量显著高于对照组(P＜0.05);而Sevo+LPS组与LPS组相比，LDH和CK－MB含量显著下降(P＜0.05)。

Figure 1. Representative M－mode echocardiograms at the papillary muscle level obtained from the mice in various group.图1 各组小鼠乳头肌水平M型超声心动图

表1 各组小鼠心功能Table 1.The cardiac functions of the mice in various groups(x珋±s.n=10)

表2 各组小鼠血清LDH和CK－MB水平Table 2.Serum levels of LDH and CK－MB in various groups (U/L.珋x±s.n=10)

3 心肌组织病理变化

LPS或生理盐水腹腔注射后12 h，光镜下观察结果见图2。对照组和Sevo组心肌纤维组织排列致密整齐、细胞结构正常、核清晰，细胞间隙内无渗出和炎症细胞浸润;LPS组心肌纤维组织排列稀疏紊乱，细胞结构模糊，且细胞间隙内有明显的渗出，红细胞和白细胞浸润;而Sevo+LPS组心肌纤维组织排列较为整齐，细胞结构较为清晰，细胞间隙内无明显的渗出，炎症细胞浸润相对减少。

4 心肌NO含量和iNOS活性

图3显示，对照组和Sevo组之间心肌NO含量无显著差异(P＞0.05)，在LPS腹腔注射后12 h，心肌NO含量显著增加(P＜0.05)，七氟醚预处理组小鼠心肌组织中 NO含量较 LPS组显著降低(P＜0.05)。图4显示，LPS组心肌iNOS活性显著高于对照组(P＜0.05);七氟醚预处理组与LPS组相比，iNOS活性则显著降低(P＜0.05)。

Figure 2. Representative HE sections of hearts from the mice 12 h after LPS or normal saline injection.图2 LPS或生理盐水注射后12 h各组小鼠心肌HE染色

Figure 3. Myocardial NO content in various groups.珋x±s.n= 10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.图3 各组小鼠心肌组织NO含量

Figure 4. Myocardial iNOS activity in various groups.珋x±s.n= 10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.图4 各组小鼠心肌组织iNOS活性

讨论

本研究沿用本实验室已经建立的成熟和稳定动物模型［7］，即采用BALB/c小鼠腹腔注射LPS(18 mg/kg)复制内毒素血症动物模型，而后从心功能、心功酶学、心肌形态等方面评价七氟醚(Sevo)预处理对内毒素血症小鼠心功能障碍的影响。实验采用小动物超声检测仪对小鼠心功能进行了无创检测和评价，其结果显示LPS处理后12 h的小鼠心功能有明显变化:左心室的SV、CO、EF显著降低、LVEDV增大，提示LPS攻击后的小鼠左心室射血功能有所降低，导致LVEDV增大。这一结果与Li等［8］的研究有相似之处。他们还认为在LPS的研究中选择与前后负荷相关的指标可以避免得出不恰当的结论。故本实验结果究其原因可能与LPS损伤血管内皮细胞，增加外周循环阻力;心脏长时间代偿最终导致失代偿，进而导致心功能降低，心脏不能有效泵血，导致血液潴留，进而引起LVEDV升高。而Sevo预处理组左室的SV和CO较正常组虽有所降低，但较LPS组EF有所改善且LVEDV(前负荷)减小，提示Sevo预处理可在一定程度上改善心功能，减轻LPS所导致的心功能障碍。此外，LPS处理后12 h的病理结果显示:心肌纤维组织排列稀疏紊乱，细胞结构模糊，且细胞间隙内有明显的渗出，红细胞和白细胞浸润，提示在LPS的攻击下心肌细胞存在损伤和炎症反应;而Sevo预处理组的心肌纤维组织排列较为整齐，细胞结构也较为清晰，细胞间隙未见明显的渗出且炎性细胞浸润相对减少，说明Sevo预处理可以在一定程度上对抗LPS所导致的心肌损伤。不仅如此，心肌细胞血清酶学检测的结果也印证了这一结果，LPS组小鼠血清的LDH和CK－MB显著升高，说明心肌有损伤;而Sevo预处理的小鼠血清LDH和CK－MB水平则显著下降，说明心肌损伤有减轻。因此，七氟醚预处理可在一定程度上对抗LPS所致的心功能障碍，保护心肌组织结构，减轻心肌细胞的损伤。

目前，LPS引起心功能障碍的机制尚未完全阐明。LPS引起心肌细胞大量生成NO可能发挥了重要作用。血管内皮细胞中的NOS催化L－精氨酸，经过一系列反应而生成NO，作为气体信号分子，在生理和病理条件下，均具有重要的调节血管功能的作用:生理状态下，适量的NO水平对维持血管张力的恒定和调节血压的稳定有重要作用，有心血管的保护作用;而过量的NO，作为一种炎症介质或反应极强的自由基，可直接或间接引起心肌损伤:(1)NO与超氧离子反应生成过氧亚硝基(ONOO－)，可影响蛋白质的结构、功能和/或催化活性，对心肌细胞产生直接毒性作用;(2)NO激活心肌细胞中鸟苷酸环化酶，促进磷酸鸟苷环化产生环磷酸鸟苷(cGMP)，继而激活依赖cGMP的蛋白激酶G(protein kinase G，，PKG)，使心肌肌钙蛋白I的磷酸化作用加强，肌钙蛋白C对Ca2+的亲合性下降，同时减少Ca2+内流［9］;(3)过量的NO可抑制心肌细胞线粒体呼吸相关酶，干扰心肌能量代谢［10］等。本实验中，LPS处理后12 h，小鼠心肌组织NO含量升高，而Sevo预处理组NO则显著下降，表明七氟醚预处理对抗LPS所致心功能障碍的作用机制可能与其抑制LPS诱导的心肌NO升高有关。

我们知道，NO的产生与一氧化氮合酶(NOS)关系密不可分，NOS可分为结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)，cNOS在生理状态下合成少量NO，参与信息转导、调节血管紧张度、调节血小板聚集等正常生理调节作用;iNOS常被内、外毒素和细胞因子激活，合成大量NO，行使其免疫信使和细胞毒的作用。在LPS诱导下，心肌细胞亦可大量表达iNOS，合成过量的NO，继而发挥损伤作用［11］。有学者［12－13］分别在脑、肾缺血再灌注损伤的研究中发现，七氟醚预处理在缺血再灌注损伤时可抑制iNOS的激活，抑制海马组织、肾组织的NO水平升高，发挥器官保护作用。本实验结果亦显示，LPS处理后12 h，小鼠心肌组织iNOS活性升高，而Sevo预处理组较LPS组显著降低。因此，七氟醚预处理可能通过抑制iNOS活性、减少NO的产生而发挥其对内毒素血症小鼠心肌的保护作用。

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Effects of sevoflurane preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide－challenged mice

LI Jian－ling1，ZHU Xiao－qing2，LI Xue－min2，LI Hong－mei2，WANG Yan－ping2，WANG Yuan2，QI Ren－bin2，LI Ya－lan1
(1Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital，2Department of Pathophysiology，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine of People＇s Republic of China，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E－mail:tyalan@jnu.edu.cn;tqirb@jnu.edu.cn)

AIM:To investigate the effects of sevoflurane(Sevo)preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide(LPS)－challenged mice.METHODS:Forty male BALB/c mice were randomly allocated to 4 groups: control group，LPS group，Sevo+LPS group and Sevo group.Following pretreatment with or without 2%Sevo for 30 min and washing out for 10 min，all mice

intraperitoneal injection of LPS or normal saline(NS).The mice received an echocardiographic evaluation by a high－resolution in vivo imaging system 12 h after administration of LPS or NS.The mice were then killed and the hearts were removed for histological analysis.Serum levels of lactic dehydrogenase(LDH)，creatine kinase－MB(CK－MB)were measured with an automatic biochemical analyzer.The myocardium was homogenized for detecting the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and the content of nitric oxide(NO).RESULTS:Echocardiographic evaluation demonstrated that LPS resulted in an increase in lert ventricular end－diastolic volume and significant decreases in stroke volume，cardiac output and ejection fraction.The alteration of cardiac functions was inhibited by the pretreatment with Sevo.LPS caused significant elevation of LDH and CK－MB in serum samples and severe pathological damage of the hearts.Compared with LPS group，serum levels of LDH and CK－MB were reduced and pathological damage was attenuated in Sevo+LPS group.Sevo preconditioning also significantly attenuated the increases in iNOS and NO induced by LPS.CONCLUSION:Sevo preconditioning protects against myocardial impairment and myocardial dys-function in LPS－challenged mice.Inhibition of iNOS activity and of NO production by Sevo preconditioning may contribute to the beneficial role in the process of cardioprotection during endotoxemia.

Sevoflurane;Preconditioning;Lipopolysaccharides;Cardioprotection;Nitric oxide synthase;Nitric oxide

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2012.08.013

1000－4718(2012)08－1410－05

2012－06－26

2012－07－09

广东省科技计划项目(No.2009B030801032);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(No.21612446)

△通讯作者李雅兰Tel:020－38688200;E－mail:tyalan@jnu.edu.cn;戚仁斌Tel:020－85220253;E－mail:tqirb@ jnu.edu.cn