转化生长因子β1和Smad4蛋白在肝癌组织中的表达及其意义

马洪波，黄 涛，韩 风，陈伟瑜

我国约有90%的肝癌患者具有乙型肝炎背景，部分患者存在丙型肝炎病毒 (HCV)、乙型肝炎病毒 (HBV)以及丁型肝炎病毒 (HDV)的重叠感染，其在经过长期的慢性炎症后可逐渐演变为肝硬化等。现代分子生物学研究发现，转化生长因子β1－抑癌基因 (TGF－β1－Smad)信号通路在肝纤维化、肝炎、肝硬化过程中扮演着重要角色，是目前分子生物学研究的热点之一［1］。Smad4蛋白由DPC4基因编码，是一类对TGF－β1信号起转导作用的胞质信号级联效应分子，具有受体激活型效应的Smad(R－Smad)受到信号刺激后会发生磷酸化，导致蛋白自身的构象发生变化并与同型的Smad4蛋白相互结合而形成寡聚体，寡聚体转位入核之后则参与调控很多靶基因的表达，发挥TGF－β1－Smad信号通路的调控效应;而抑制型的Smad(I－Smad)也必须和Smad4蛋白进行相互作用后才可抑制TGF－β1信号向下一级传递［2－3］。DPC4基因所编码的蛋白即Smad4蛋白对整个TGF－β1－Smad信号转导途径起关键作用，该基因的表达异常会引发细胞无限增殖的现象，研究TGF－β1与Smad4蛋白在肝癌组织中的表达具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年3月—2011年4月我院收治的肝癌患者54例，其中男31例，女23例，年龄24～67岁，平均44.9岁。肿瘤分期:Ⅰ期14例，无显著肝癌症状和体征;Ⅲ期19例，有腹腔积液、黄疸、远处转移、恶液质症状之一;Ⅱ期21例，症状介于Ⅰ期与Ⅲ期之间。患者的肝癌组织均在术后冷冻保存备用;同时选取患者的癌旁组织分别编号冷冻后备用。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 浓缩型兔抗人TGF－β1和Smad4蛋白单克隆抗体均购自Sigema公司，工作浓度为1∶200。原位杂交检测试剂盒、二氨基联苯胺 (DAB)试剂盒、链霉亲和素－过氧化复合物 (ABC)等购自罗氏公司。

1.2.2 实验方案 采用原位杂交显色法 (IHCABC法)，TGF－β1以及Smad4一抗工作浓度均为1∶200，行DAB显色及常规原位杂交 (ISH)。以磷酸盐缓冲液 (PBS)为阴性对照，以有淋巴结转移的癌组织作为阳性对照。蛋白质原位杂交与RNA原位杂交按照《分子克隆实验指南》［4］进行。对肝癌组织及癌旁组织Smad4 mRNA和Smad4蛋白表达量进行分析，确定肝癌组织及癌旁组织中DPC4基因在转录和翻译水平上是否存在差异，即Smad4 mRNA和Smad4蛋白的差异。若存在差异 (已经预实验证实)，则进一步探讨Smad4蛋白与TGF－β1的相关性，寻找二者的关系。

1.3 结果判定 在400倍光镜下随机选取8个视野进行拍照，胞质及胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞的结构必须清晰，着色明显且定位准确，计算阳性染色面积所占比例，阳性细胞面积占总面积的80%及以上计4分;占总面积的50%～79%计3分;占总面积的10%～49%计2分;小于总面积的10%计1分;不着色为阴性，计0分。同时进行光密度半定量分析，并求得其平均值，按阳性信号的强度计分，阴性计0分，弱阳性计2～3分，中度阳性计4～5分，强阳性计6～7分。阳性面积评分和信号强度评分的乘积为总分，总分≤5分为低表达，＞5分为高表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料以 (±s)表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表达和半定量结果 Smad4蛋白在肝癌组织中高表达21例，高表达率为38.9%;癌旁组织中高表达25例，高表达率为46.3%，两种组织中Smad4蛋白高表达率比较，差异有统计学意义 (χ2=16.59，P=0.01);Smad4 mRNA在肝癌组织中高表达28例，高表达率为51.9%;癌旁组织中高表达36例，高表达率为66.7%，两种组织中Smad4 mRNA高表达率比较，差异有统计学意义 (χ2=7.83，P=0.01)。肝癌组织中Smad4蛋白阳性面积与癌旁组织比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)，光密度值比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);肝癌组织中Smad4 mRNA阳性面积和光密度值与癌旁组织比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

表1 肝癌组织及癌旁组织中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表达和半定量结果 (±s，n=54)Table 1 The expression and semi－quantitative results of Smad4 gene and Smad4 mRNA in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

表1 肝癌组织及癌旁组织中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表达和半定量结果 (±s，n=54)Table 1 The expression and semi－quantitative results of Smad4 gene and Smad4 mRNA in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

组织类型 阳性面积 (μm2)Smad4蛋白Smad4 mRNA肝癌组织 32.93±17.62 26.53±13.51 0.11±0.01 0.17±0.01 Smad4 mRNA光密度Smad4蛋白癌旁组织 33.14±15.97 45.12±15.27 0.22±0.01 0.26±0.01 t 0.97 17.93 9.71 11.64 P值值0.62 0.01 0.02 0.01

2.2 肝癌组织中TGF－β1表达和Smad4蛋白表达与临床病理特征的关系 肝癌组织中TGF－β1和Smad4蛋白高表达率在男女间，差异均无统计学意义 (P＞0.05);以45岁为界，肝癌组织中TGF－β1和Smad4蛋白高表达率在不同年龄间比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05);在不同病理分期间比较，差异亦均有统计学意义 (P＜0.05)，且随着病理分期增加，TGF－β1和Smad4蛋白高表达率明显升高 (见表2)。

表2 肝癌组织中TGF－β1表达和Smad4蛋白表达与病理特征的关系〔n(%)，n=54〕Table 2 Relationship between the expression of TGF－β1and Smad4 protein in HCC tissues and clinical pathological features

3 讨论

肿瘤的发生发展是多因素、多基因表达共同变化的过程，主要与癌基因的激活及抑癌基因的失活或受抑制有关，细胞增殖和细胞信号转导途径在其中扮演着重要角色［5－6］。TGF－β1对细胞的调控机制非常复杂，主要通过多条信号转导通路来完成，在这些信号转导通路中有TGF－β1以及相关受体蛋白尤其是Smad蛋白家族参与。这些作用分子的功能及状态影响着细胞对生长调节信号的传导、应答及反馈。TGF－β1参与细胞的多种基因调控，是很多与肿瘤组织生长有关的负调节因子，在人体细胞分化以及恶性肿瘤行为中具有重要作用。DPC4基因是在上个世纪由Hongmei等［7］发现的新型抑癌基因，是TGF－β1－Smad信号通路的关键转录因子，可看做是一个中心分子。而Smad 4蛋白能够与Smad家族成员的任意一种发生相互作用，一旦DPC4基因发生缺失、突变或沉默，将导致其功能丧失，进而导致整个信号通路甚至整个细胞代谢发生紊乱，最终形成肿瘤［8］。受 DPC4基因调控的下游基因有 p21、TSP1等。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制物，能够抑制CDK与细胞周期蛋白形成复合物，并使细胞生长停留在G1期，进而调控细胞的分裂增殖。其他下游基因主要调控一些细胞的增殖分化、凋亡以及血管生成。胃癌、胰腺癌、乳腺癌等均与DPC4基因的缺失和突变有关，TGF－β1－Smad信号通路对于肿瘤的发生发展极其重要［10－12］。

本研究结果显示，肝癌组织中Smad4蛋白高表达率和半定量结果均低于癌旁组织，说明肝癌细胞内部DPC4基因呈低表达甚至不表达，使得TGF－β1－Smad信号通路受阻，进而导致机体对肝癌细胞的分裂、分化和增殖失去控制。如果肝癌细胞能重新正常表达DPC4基因，可能会有效地抑制肝癌的进一步发展。肝癌组织中TGF－β1和Smad4蛋白高表达与患者性别无关，而与病理分期和年龄增长 (≥45岁)有关。但本研究样本例数有限，所采用的方法本身存在一定的局限性，只能揭示Smad4蛋白在肝癌组织和癌旁组织的表达特征，要想得到Smad4蛋白与肝癌发生关系的直接证据，需构建DPC4基因表达载体，进一步研究其在肝癌组织中的病理变化，深入探讨TGF－β1和Smad4蛋白的作用。

1 Samarakoon R，Chitnis SS，Higgins SP，et al.Redox－ induced Src kinase and caveolin－1 signaling in TGF－β1－initiated SMAD 2/3 activation and PAI－ 1 expression ［J］.PLoS One，2011，6(7):e22896.

2 Wang QL，Tao YY，Yuan JL，et al.Salvianolic acid B prevents epithelial－to－mesenchymal transition through the TGF－beta1signal transduction pathway in vivo and in vitro ［J］.BMC Cell Biol，2010，11:31.

3 Mickey M，Martin，Jessica A，et al.Elton TGF － β1stimulates human AT1 receptor expression in lung fibroblasts by cross talk between the Smad，p38 MAPK，JNK，and PI3K signaling pathways［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293(3):L790 －L799.

4 黄培堂译.分子克隆实验指南 (上下册) ［M］.科学出版社，2005:1012－1633.

5 Piyali Mukherjee，Sherry L，Winter，et al.Cell cycle arrest by transforming growth factor β1near G1/S is mediated by acute abrogation of prereplication complex activation involving an Rb－MCM interaction［J］.Mol Cell Biol，2010，30(3):845 －856.6 Huang WC，Yen FC，Shie FS，et al.TGF －β1blockade of microglial chemotaxis toward Aβ aggregates involves SMAD signaling and downregulation of CCL5 ［J］.J Neuroinflammation，2010，7:28.

7 Hongmei Peng，Oscar A，Carretero，et al.Ac－ SDKP inhibits transforming growth factor－β1－induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(5):H1357－H1364.

8 陈国平，夏立平.TGF－β/Smads信号转导途径与肿瘤的关系［J］.海南医学院学报，2009，15(1):91.

9 夏立平，刘晓力，陈国平，等.TGF－β1、TGF－βR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系［J］.海南医学院学报，2010，16(6):693－698.

10 丁平，宋炳红，朱利敏，等.TGF－β/Smad4基因信号通路对结直肠癌肿瘤细胞株转移潜能影响的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18(19):1519－1521.

11 程朋，曾维政，苏晓妹，等.TGFβ1与Smad4基因在肝细胞癌中的表达及意义 ［J］.临床肿瘤学杂志，2009，14(7):609－613.

12 陈桂敏，王少贤.肝纤维化TGF－β1/smad信号通路中医药研究进展［J］.海南医学院学报，2010，16(6):810－812.