Notch1胞内段在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株中的表达研究

张芳婷，万汇涓，李明华，刘晓翌，尹美珺，叶 静，于 洁

Notch信号通路作为经典的调节细胞增殖和分化的信号转导通路，在一系列生理和病理过程中起着重要作用。近年来研究证实，Notch信号通路参与了鼻咽癌的发生过程，但至今机制仍不明确。探讨其在鼻咽癌发生发展中的作用将为发现鼻咽癌治疗的新靶点提供理论基础。由于非角化性鼻咽癌 (nonkeratin naspharyngeal carcinoma，NK-NPC)是鼻咽癌高发区的主要类型，因此本研究拟通过免疫组化染色与分子生物学技术研究Notch1在鼻咽癌中的表达。

1 材料与方法

1．1 材料 CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株购自深圳欣海凌生物科技有限公司，SUNE-1、SUNE-1亚株5-8F、SUNE-1亚株6-10B及SUNE-1亚株9-4E鼻咽癌细胞株购自湘雅医学院细胞中心，52个NK-NPC标本以及10例鼻黏膜炎症标本来源于北京大学深圳医院耳鼻喉科，由北京大学深圳医院病理科提供。

1．2 试剂 1640培养基 (GIBCO公司)、胎牛血清 (FBS，GIBCO公司)、磷酸盐缓冲液 (PBS，GIBCO公司)、胰蛋白酶 (AMRESCO公司)、青链霉素(双抗100×，Hyclone)、台盼蓝 (SIGMA公司)。RNA提取试剂盒 (QIAGEN)，cDNA反转录试剂盒 (Fermentas)，单克隆抗人Notch1 IC抗体 (RD)，即用型免疫组化Elivision TM super试剂盒 (迈新生物技术开发有限公司);RNA提取试剂盒 (Qiagen公司);RT-PCR试剂(Fermentas公司);DNA Maker I(Tiangen公司);人Notch1引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，上游引物5′-GCCGCCTTTGTGCTTCTGTTCTTC-3′，下游引物 5′-CCCGTGCGGTCTGTCTGGTTGTG-3′，产物长度为506 bp。内参 β-actin扩增片段大小204 bp，序列为F:GTGACGTGGACATCCGCAAAG，R:GGAGAATGGACAGCGAGGC。

1．3 方法

1．3．1 总RNA提取与反转录聚合酶链反应 (RT-PCR)法检测 将各种鼻咽癌细胞株常规培养至3代，收集细胞，TRIZOL抽提RNA;RT-PCR操作按说明书进行，扩增条件为:48℃ 45 min;94℃ 2min;94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环;72℃ 7 min，采用1．2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。

1．3．2 免疫细胞化学染色 常规制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，晾干后备用。实验时先用过氧化物酶阻断剂、非免疫血清各反应10 min，甩弃多余液体后加抗人Notch1 IC抗体室温孵育60 min。PBS洗后，加生物素标记二抗10 min、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶10 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下选取数个高倍视野进行细胞计数，共计1 000个细胞。

1．3．3 免疫组化染色 常规石蜡切片，切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水至水化，双蒸水洗5 min，3%H2O2甲醇液灭活内源性过氧化物酶活性，微波热修复95℃20min，自然冷却。蒸馏水洗5 min，PBS洗10 min，滴加山羊血清封闭，室温10 min;滴加一抗，室温1 h或4℃过夜，PBS洗3次，5 min/次;滴加生物素标记二抗，室温10 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加过氧化物标记的链霉亲和素，室温10 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加DAB显色剂，镜下控制，蒸馏水终止显色，苏木素轻度复染，脱水、透明、中性树胶封片。

1．3．4 结果判定标准 免疫组化染色可定位于细胞核、细胞质中，呈棕黄色颗粒。每张切片均于400倍光镜下随机观察10个高倍视野1 000个细胞，阳性细胞数＜20%为阴性，≥20%为阳性。

1．3．5 病理学检测 常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织细胞和形态学变化。

1．4 统计学方法 采用SPSS 13．0统计软件进行统计学分析。计数资料采用Personχ2检验和确切概率法。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 RT-PCR检测 经RT-PCR后，琼脂糖凝胶电泳显示了不同鼻咽癌细胞株中Notch1基因的表达情况，可见各组细胞在506 bp的位置均出现产物带，其中以CNE1表达最强，其他细胞株表达较弱 (见图1)。

2．2 免疫细胞化学染色 制备细胞爬片，免疫细胞化学染色结果显示:人Notch1胞内段 (NIC)在CNE1细胞株中有阳性表达，在其他细胞株中几无表达 (见图2)。

2．3 免疫组化染色 在未分化型鼻咽癌中，癌巢内无阳性表达，周围淋巴细胞阳性表达;在分化型鼻咽癌中，癌细胞阳性表达明显，而在鼻咽慢性黏膜炎症组织几乎未见阳性表达。NIC阳性染色为棕色，阳性表达位置不固定，可见于胞膜、胞核，或弥漫表达于胞质中。在未分化型鼻咽癌中定位于核内阳性细胞较分化型鼻咽癌多 (见图2)。在未分化型鼻咽癌中可见数量不等的淋巴细胞浸润。病理学染色及免疫组化染色结果对比显示:癌巢本身Notch1染色呈阴性表达，而癌巢内浸润的淋巴细胞则表达阳性。

2．4 鼻咽癌组织中NIC的表达高于鼻咽慢性黏膜炎症组织(χ2=7．8，P=0．005)。对所有鼻咽癌临床标本进行性别、年龄、组织学分型方面的统计，发现NIC的表达在不同年龄、性别患者中差异无统计学意义 (P＞0．05);而在未分化型和分化型鼻咽癌中，NIC的阳性表达率差异有统计学意义 (P＜0．05，见表 1)。

3 讨论

Notch信号通路由受体、配体和CSL DNA结合蛋白3部分组成。其经典作用路径为:当Notch受体受到配体的刺激后，身为跨膜受体蛋白的Notch分子由细胞膜上的蛋白酶复合物催化发生蛋白裂解，使NIC从细胞膜内侧释放并进入核内。进入核内的胞内段与转录因子RBP-J相互作用，激活含有RBP-J识别位点的启动子的转录，从而调节细胞分化相关基因如Hes家族分子的表达，并调节细胞的分化［1］。

图1 鼻咽癌细胞株中人Notch1基因的表达Figure 1 Electrophoretogram of Notch1 mRNA RT-PCR product

图2 人Notch1胞内段在鼻咽癌细胞及组织中的表达Figure 2 Expression of Notch1 intracellular domain in NK-NP C

表1 NIC在鼻咽癌中的表达情况Table 1 Expression of NIC in the NPC

Notch信号通路参与了鼻咽癌的发生过程，但至今机制仍不明确。病因学研究显示:鼻咽癌的发生与EBV感染密切相关。EBV感染的B淋巴细胞永生化依赖于EB病毒核心抗原2(EBNA2)。EBNA2通过与Notch通路的核内转录因子RBP-J结合以活化c-myc、CD21、CD23、STAT6等基因，从而达到调控EBV对B淋巴细胞感染的过程［2］。因此，目前有推测认为:这一感染途径可能的机制是，上皮细胞与EBV阳性B淋巴细胞紧密接触进而引发上皮细胞感染［3］。

在哺乳动物的4种Notch受体 (Notch1～4)中，Notch1与肿瘤的关系最为密切［4-5］，因此，本研究选择具有活性的NIC以研究其在鼻咽癌中的表达。

本研究结果显示，在不同分化程度鼻咽癌细胞、组织中NIC表达有所差异，与患者年龄、性别无相关性，而与细胞分化程度相关，呈现分化程度越低表达量越低的趋势。从慢性炎症组织到分化型鼻咽癌，再到未分化型鼻咽癌，NIC的表达量逐渐增加，其定位由胞质至胞核，而未分化型鼻咽癌NIC主要表达于侵入癌巢的淋巴细胞上，提示Notch1在鼻咽癌发生中有促进作用，其作用途径可能与淋巴细胞侵润相关。这一结果符合有关EBV感染鼻黏膜上皮细胞机制的推断，也与Wang等［6］的研究结果基本一致，而Notch1受体活化途径和EB病毒感染途径是否一致，还有待进行深入探讨和研究。

1 Artavanis-Tsakonas S，Rand MD，Lake RJ．Notch signaling:cell fate control and signal integration in development［J］．Science，1999，284(5415):770-776．

2 Barozzi P，Potenza L，Riva G，etal．B cells and herpesviruses amodel of lymphoproliferation［J］．Autoimmun Rev，2007，7(2):132-136．

3 Zong YS，Zhong BL，Liang YJ，et al．Advancement of studying the biological characteristics of nasopharyngeal carcinogenesis［J］．Ai Zheng，2002，21(6):686-695．

4 Radtke F，Raj K．The role of Notch in tumorgenesis:oncogene or tumor suppressor?［J］．Nature Rev，2003，3(10):756-767．

5 Nicolas M，Wolfer A，Raj K，et al．Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin ［J］．Nature Genet，2003，33(3):416-421．

6 Wang M，Li JT，Zeng YX，et al．Expression and Significance of Notch1，P21WAF1 and involucrin in nasopharyngeal carcinoma［J］．Ai Zheng，2005，24(10):1230-1234．