不同低氧暴露对人红细胞硫氧还蛋白过氧化物酶PeroxiredoxinⅡ的影响

胡永欣

(广东第二师范学院体育系，广东广州 510013)

不同低氧暴露对人红细胞硫氧还蛋白过氧化物酶PeroxiredoxinⅡ的影响

胡永欣

(广东第二师范学院体育系，广东广州 510013)

目的:观察模拟高住组和间歇性低氧组经过四周低氧暴露后，人红细胞硫氧还蛋白过氧化物酶Peroxiredoxin2的变化。方法:男性大学生20名随机分成对照组、模拟高住组和间歇性低氧组，三组从事相同的身体活动、学习和生活作息，模拟高住组每天8hr低氧环境睡眠，间歇性低氧组每天安静状态吸低氧(浓度14%-10%)50-60min，连续4周。三组均在实验开始前、结束后按Bruce方案进行力竭运动，并在安静和运动后取血测试Prx2、MDA。在低氧训练实验开始前一天、实验的最后一天取血测定红细胞数目、血红蛋白及红细胞压积。结果:(1)一次性力竭运动后，Prx2的变化不大，而经过四周低氧暴露后，在完成力竭运动前，模拟高住组Prx2有升高趋势，在间歇性低氧组则达到显著性;力竭运动后，Prx2的升高在低氧组都达到了显著性;(2)力竭运动后，三组MDA明显增多，低氧暴露前后低氧组无明显变化;(3)低氧组都未观察到红细胞计数和压积、血红蛋白浓度的明显变化。结论:长时间低氧暴露可诱导Prx2的生成增多。

Prx2;RBC;MDA;间歇性低氧;高住低练

Peroxiredoxin(Prx)家族在20世纪80年代首次从酵母中提取，被命名保护蛋白(PRP)，由于PRP抗氧化活性对巯基的依赖性，又被称为巯基依赖性保护蛋白(TSA)，Prxs是一新型抗氧化蛋白家族，正受到国内外学者越来越多的关注，其DNA与蛋白序列与传统抗氧化酶没有同源性，具有抗氧化、抑制细胞凋亡、介导细胞的增殖与分化，参与了生长因子和肿瘤坏死因子α的细胞内信号转导，与肿瘤的发生等有密切关系。其广泛存在于酵母、植物及动物细胞，甚至包括原生动物、寄生虫及大部分真细菌和古细菌。它们的氨基酸、DNA序列具有同源性，根据氨基酸序列的差异，分为六个亚型，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。红细胞中含有Prx2、Prx1、Prx6，但Prx1和Prx6的含量比Prx2少很多，因此Prx2是红细胞Prx的主要亚型，酶联免疫吸附试验测定结果显示，红细胞中 Prx2的浓度为5.6mg/ml，相当于每个细胞1500万个拷贝，是红细胞中除血红蛋白和碳酸酐酶以外含量最丰富的蛋白。

低氧暴露对人体红细胞及抗氧化酶都有一定的影响，而关于Prx2在不同的低氧暴露后会有何变化，还未见相关报道，本文旨在观察模拟高住及间歇性低氧暴露，两种低氧刺激对Prx2的影响。

1 研究对象与方法

1.1 实验对象

受试者为20名体育系男大学生，随机分成3组，间歇性低氧组(n=7)、模拟高住组(n=5)和对照组(n=8)，各组无显著差异(如表1)，经询问病史，体格检查，受试者身体健康，在实验期间均从事相同的体育技术课和理论课学习及相同的生活作息。

表1 受试者基本情况

1.2 实验方法

所有受试者采用定量负荷的有氧训练方法，3次/周，以400m/1'50″左右的速度、约10-12min跑完2000m，心率控制在140-150bpm(受试者最大心率的70%-75%)。另外，间歇性吸低氧组在每日下午安静状态下间歇性吸低氧总共50-60min，6天/周，周日休息，连续4周，具体低氧训练方案见表2。吸低氧时用血氧饱和度仪监测血氧饱和度指标，同时监测心率，如果氧饱和度低于80%或/和心率过快(与自身正常对照)，则停止吸低氧，休息并观察。

模拟高住组每晚10时至清晨6时进行8h模拟低氧环境睡眠，每周6天，连续4周，呼吸14%O2。实验前1天呼吸正常空气，在低氧实验过程中，通过安全监测装置对受试者体温、心率、呼吸、血压及氧饱和度进行8h临床监护。如出现异常，由监护医生护士及时处理。

表2 间歇性低氧实验方案

所有受试者在低氧训练实验开始前1天、低氧训练实验结束后1天在Quinton Q55跑台上采用Bruce方案进行递增负荷运动至力竭，并分别在运动前安静状态和力竭运动后即刻取静脉血4ml，测定Prx，测定方法采用 ELISA法和增强型化学发光蛋白免疫印迹法。

在低氧训练实验开始的前七天和前一天取血测定基础值(两次求平均值)，低氧训练实验的最后一天取静脉血5ml，测定红细胞数目、血红蛋白及红细胞压积。所有血样在清晨同一时间、安静、空腹状态收集。

1.3 统计处理:

实验数据采用SPSS10.0统计软件进行处理，所有数据结果用均数±标准差(X±S)来表示;组间采用Independent-Samples T Test，组内采用Paired Samples T Test分析，显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 四周低氧暴露前后，各组MDA的变化

由表3可见，实验前和经过四周低氧暴露后，间歇性低氧组、模拟高住组与对照组红细胞中安静状态MDA含量无显著性差异，力竭运动后，MDA的生成均显著性升高，而组间并无差异。(P＜0.05)

2.2 四周低氧暴露前后，各组Prx2的变化

由表4可见，实验前间歇性低氧组、模拟高住组与对照组红细胞中Prx2含量无显著性差异，力竭运动后，Prx2的生成也没有明显变化;而经过四周低氧暴露后，间歇性低氧组在安静时的红细胞Prx2的含量高于四周前，在力竭运动后Prx2的含量也明显高于安静值(P＜0.05);模拟高住组在安静时的红细胞Prx2含量与四周前未见显著性差异，而力竭运动后Prx2的含量明显高于安静值，同时也高于低氧暴露前的力竭运动后(P＜0.05)(可见图1)。

2.3 四周低氧暴露前、后，各组RBC数目、Hct及Hb的变化

由表5可见，实验前间歇性低氧组、模拟高住组与对照组RBC数目、Hct及Hb组间无显著差异，间歇性低氧组在四周低氧暴露后Hct出现显著性增高(P＜0.05)，而RBC数目及Hb未见显著变化，模拟高住组在RBC数目、Hct及Hb三个指标均未出现明显变化。

表3 4周不同低氧暴露受试者红细胞中MDA的变化

表4 4周不同低氧暴露受试者红细胞中Prx2的变化

表5 4周不同低氧暴露前、后血液指标的变化

图1 4周不同低氧暴露受试者红细胞中Prx2的变化

3 讨论

在大多数细胞中，ROS(活性氧族)主要来源于线粒体;在红细胞中ROS则主要来源为运氧蛋白，Hb发生自发氧化产生过氧化物，及红细胞膜变形受到物理性应力等产生ROS，红细胞特殊的结构、生理功能和庞大的数量导致其产生很高水平的ROS，因此红细胞需要装备一系列酶来保护细胞，如Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、高铁血红蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和一类新出现的抗氧化蛋白(Prxs)。Prx2蛋白的生物学功能多样，主要有:与硫氧还蛋白协同作用，利用其活性半胱氨酸残基，有效地清除代谢产生的过氧化氢及其他活性氧类物质，通过调节过氧化氢水平，参与细胞的增殖、分化与凋亡等，介导早期红细胞系的分化。

Prx2由Lim等在1994年首先从人红细胞基质中分离纯化得到，它是一种酸性可溶性蛋白质，其基因位于13q12，编码由198个氨基酸组成的多肽，分子量约为22kD。主要分布在红细胞胞浆，并有C-末端与细胞膜相连。1998年，人Prx2的6种晶体结构被公布，其结构非常类似，均具有1个硫氧还蛋白折叠，其中插入少数几个额外的二级结构，其最显著的差异就是寡聚体的状态。二聚体和寡聚体的转变可能与其氧化还原状态的改变有密切联系［1］。

Prx2的催化效率比过氧化氢酶和GSH-Px要低很多，但Prx2对氧化异常敏感，当红细胞暴露于微摩尔级的H2O2时，尽管过氧化氢酶和GSH-Px存在，Prx2仍旧可以被氧化，只是氧化型和还原型之间转换缓慢。虽然Prx2与过氧化氢酶和GSH-Px的催化效率相对较低，但其与H2O2的亲和力却极高，而且Prx2在红细胞内含量丰富，保证了Prx2可有效清除H2O2，在红细胞抗氧化作用中发挥重要作用［2］。

关于Prxs蛋白家族在衰老、肿瘤、炎症、免疫等多种疾病或病理过程中的作用，都有不同程度的研究见报道，这些文献资料都是关于Prxs的病、生理方面的研究，而人体力竭运动及低氧刺激对其影响的文献还未见。而本实验目的正是观察在不同的低氧刺激及一次力竭运动后，对Prx2的影响。从实验结果可以看出，低氧暴露后，Prx2生成明显增多，尤其是间歇性低氧组，无论是安静值，还是力竭运动后都比低氧暴露前增多，模拟高住组只是力竭运动后比四周前明显增多，而安静值没有达到显著性，但有升高趋势。低氧条件下，H2O2、OH-生成增多，这在很多研究报道中都有体现［3］，虽然，本实验结果中，四周的低氧暴露后，MDA的安静值相比四周前无改变，推测可能是已经适应了低氧刺激。在Alina等人研究皮划艇运动员在2000m高原上训练，分别在平原、刚上高原及高原第4、10、18天对红细胞自由基代谢进行了观察，发现低氧环境会使自由基生成明显增多，第10天开始有所回降，但仍明显高于平原时水平［4］。可能正是增多的自由基的不断刺激，人体红细胞Prx2生成增多。研究显示:Prx2可被过氧化氢诱导而升高，过氧化物可诱导小鼠Prx2、Prx1及Prx3表达升高［5］;Prxs蛋白在很多肿瘤细胞中表达增高，目前普遍认为这是肿瘤细胞内高活性氧水平诱导的原因［6］;Prx2缺陷的小鼠可以正常发育并成熟，但是其外周血中可以检测到海因茨体，红细胞中异常形态细胞数量增加，活性氧族的含量也增加，这从反面证实了该基因的抗氧化作用［7］。本实验中，间歇性低氧组比模拟高住组Prx2生成的更多，推测是由于间歇性低氧组的氧浓度更低，进一步说明低氧的浓度，诱导Prx2生成得程度也不同。

在本实验中，由于未观察到RBC数量及Hb浓度的升高，只是Hct有升高现象，估计在一些使RBC数量及Hb浓度的升高的低氧训练中，Prx2也许会生成得更多，这还有待于进一步的研究证实。

实验结果还可以观察到低氧暴露前一次性力竭运动对Prx2没有影响，而低氧暴露四周后，无论哪种低氧暴露，一次性力竭运动后Prx2生成都明显增多，既高于安静值也高于四周低氧暴露前，这可能是在力竭运动中，自由基明显生成增多，而四周不断的低氧刺激，Fe3+、H2O2、OH-的增多更易诱导Prx2的生成;也可能是Prx2寡聚体转变的速度加快，或者硫氧还蛋白的含量也增多，使得Prx2从氧化型转变成还原型更容易，磷酸化、过氧化和蛋白水解等因素都是Prx2酶活性调节的主要因素［2］，而关于Prx2的调控机理仍处于探索研究中，分析实验的结果还需更详细的探讨。

4 总结

在四周低氧暴露前，一次性力竭运动对Prx2的影响不大，而经过四周低氧暴露后，一次性力竭运动后Prx2发生显著变化，模拟高住组在安静状态下，Prx2的生成有升高趋势，在间歇性低氧组则达到显著性，而在完成力竭运动后，Prx2的生成在两组都达到了显著性，不仅高于安静值，而且高于四周前的力竭运动值，说明长时间低氧暴露可诱导Prx2的生成增多，提高红细胞的抗氧化能力。而关于Prx2活性调节，低氧刺激使得H2O2、OH-的增多，诱导了Prx2的生成，而低氧刺激引起RBC数量的增多，或者血液内环境改变等因素对Prx2的影响在本实验中未能观察到，还需进一步的研究探讨。

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［5］王蔚，祁婷婷，刘芸，等.过氧化物氧还蛋白家族的功能及调节机制［J］.生命的化学，2010，30(2):184-188

［6］曾跃平，刘洁，王宝玺.过氧化酶Peroxiredoxin家族与肿瘤关系研究进展［J］.癌症进展，2010，8(2):164-166

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Effect of Different Hypoxic Environment Exposure on PeroxiredoxinⅡ

HU Yong-xin
(Department of Physical Education of Guangdong University of Education，Guangzhou 510013，China)

Objective The paper investigated the effects of different hypoxia exposure on PeroxiredoxinⅡ.Methods Twenty healthy male students were randomly assigned to three group with following protocols:control group(C)，intermittent hypoxia exposure(IH)and mimic lived high and trained low group(MH).The IH group intermittently inhaled different hypoxic gas mixtures(O2 were 14%，12%，10%，respectively)，50-60 min daily for 4 weeks.MH group was exposed to hypoxic environment for 8 hours each night.Three groups completed Bruce protocol exercise on the treadmill before and after hypoxic exposure.Results 1)Before hypoxic exposure，there were no significantly changes of Prx2 after exhaustive exercise.After 4 weeks of hypoxic exposure，Prx2 in MH and IH group were significantly increased.2)MDA in three groups were significantly change after exhaustive exercise.There were no change between before and after hypoxic exposure.3)Changes of RBC、HCT and Hb were not investigated between three groups after hypoxic exposure.Conclusion 4 weeks hypoxic exposure is effective on improving Prx2.

Prx2;RBC;MDA;intermittent hypoxia exposure;lived high and trained low

G804.7

A

1007-323X(2012)03-0084-04

2012-02-25

胡永欣(1973-)，女，讲师，硕士

研究方向:运动生理学