雪卡毒素的提取纯化方法初步研究＊

闫鸿鹏，张彩霞，赵肃清，张 焜

（广东工业大学，广东 广州510006）

雪卡毒素的提取纯化方法初步研究＊

闫鸿鹏，张彩霞，赵肃清＊，张 焜

（广东工业大学，广东 广州510006）

雪卡毒素（ciguatoxin）是一类具有神经毒性的海洋藻类毒素，高纯度雪卡毒素是开展其相关研究的物质基础。以石斑鱼肝脏为原料，对其脂溶性粗提物经Florisil柱和Sephadex LH－20柱纯化后，用高效液相色谱／质谱（HPLC／MS）和细胞毒性方法对其进行鉴定，证明为太平洋雪卡毒素（P－CTX－1）。HPLC鉴定分析提取物与太平洋雪卡毒素（P－CTX－1）具有相同的保留时间。HPLC／MS检测表明纯化样品在m／z＝1 111.3和m／z＝1 133.0处出现雪卡毒素［M＋H］＋峰和［M＋Na］＋峰，与已有的P－CTX－1分子离子峰完全吻合。四甲基偶氮唑蓝法（MTT）细胞毒性试验证明了雪卡毒素样品对人神经母细胞瘤（SK－N－SH）具有毒性作用，毒素剂量与细胞生长抑制率成线性关系。细胞毒性试验进一步确认该提取物为雪卡毒素，且纯度较高。

雪卡毒素；提取；纯化；HPLC／MS；MTT

雪卡毒素（ciguatoxin，CTX）是一类可引起人类中毒的海洋珊瑚鱼毒素［1］，主要来自于剧毒冈比亚藻（Gambierdiscus toxicus），可通过食物链，由小鱼到大鱼层层传递积累。太平洋雪卡毒素－1（结构式如图1）无论从数量上以及毒性上都是最主要的雪卡毒素，在总致死率上约占90%，在我国深圳、广州等地每年因食用含雪卡毒素石斑鱼而中毒的超过2 000人［2－3］，是造成我国雪卡毒素食物中毒的主要亚型。制备高纯度的雪卡毒素对开展其相关研究至关重要，但是雪卡毒素在鱼体内含量极低，提纯雪卡毒素相当困难，致使其标准品价格非常昂贵［4－6］。国外学者对雪卡毒素提取纯化及鉴定进行了大量研究，Lewis等1991年利用有机溶剂甲醇、丙酮等从鱼体内提取雪卡毒素粗提物，再经过一系列纯化工艺能制得纯度较高雪卡毒素，日本从1909年开始，花费49a才从珊瑚鱼的卵巢中提取分离出雪卡毒素，又用了近10a才完成其工业提取的研究［7－8］，雪卡毒素纯品的制备一直是国际国内研究热点。我们以广东汕头、湛江等地的石斑鱼鱼肝为原料，初步研究了雪卡毒素的提取纯化方法，采用高效液相色谱／质谱法和细胞毒性试验［9］对纯化样品进行分析鉴定，为雪卡毒素制备及鉴定研究提供了一定依据，为开展雪卡毒素相关研究工作奠定了基础。

1 实验材料

1.1 材 料

雪卡毒素（P－CTX－1）标准品由澳大利亚昆士兰大学Lewis教授实验室提供，SK－N－SH细胞（人神经母细胞瘤）由中山大学实验动物中心提供，石斑鱼鱼肝收集于广东汕头海滨海鲜市场、湛江霞山水产批发市场。

图1 太平洋雪卡毒素1结构式Fig.1 Structure of P－CTX－1

1.2 实验试剂

藜芦定和乌本苷（深圳疾控中心惠赠）；甲醇（Methanol）、正己烷（hexane）、乙醇（ethanol）、丙酮（acetone）、三氯甲烷（Chloroform）（天津市百世化工有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；Florisil吸附剂和Sephadex LH－20（上海源叶生物科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI－1640（GIBCO）；0.25%－EDTA胰蛋白酶（美国Amresco公司）；四甲基偶氮唑蓝 （MTT，美国Sigma公司）。

1.3 仪器与设备

高效液相色谱仪采用岛津LC－20A系统（光电二极管阵列检测器）；LCQ DECAXP液相－电喷雾质谱仪（美国Thermo－Finniga公司）操作软件为 Xcalliber；色谱柱：Hypesil ODS 150mm×2.1mm，粒径为3.5 μm；RT－2100C酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；CO2细胞培养箱（美国Shellab公司）；TU－1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

2 实验方法

2.1 雪卡毒素的提取

将250g鱼肝切碎置于100mL的密封离心管中，70℃蒸煮20min，加适量甲醇：正己烷＝3∶1（体积比）均质［10］。加入750mL的甲醇：正己烷＝3∶1（体积比）搅拌15min，4 000r／min离心20min，弃掉上层正己烷层。重复3次，合并甲醇相，转移到一次性注射器中，经0.45μm微孔滤膜过滤［11］，制得到雪卡毒素粗提物。真空干燥，置于－20℃备用。

2.2 雪卡毒素的纯化

1）Florisil柱：预处理（马弗炉600℃灼烧4h）60～100目硅镁型吸附剂，取150g装柱（4.5cm×45 cm）。用3Vbh∶a∶m（正己烷∶丙酮∶甲醇）＝0∶9∶1（体积比）润洗，上样，用5Vbh∶a∶m＝3∶1∶0（体积比）洗脱，收集洗脱液真空干燥后称重。最后用2Vbh∶a∶m＝0∶0∶1清洗柱子。

2）Sephadex LH－20柱：取上一步得到的样品过Sephadex LH－20柱（3cm×120cm），用三氯甲烷与甲醇（体积比为1∶1）做流动相洗脱控制流速2mL／min。分段收集洗脱液，HPLC检测分析纯化过程各部分收集液，通过比较各部分收集液的色谱图与标准品色谱图保留时间，确定含有雪卡毒素的部分，收集Ve／Vb＝0.41～0.48的部分样品，真空干燥称重。

2.3 HPLC／MS鉴定

HPLC分析条件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A为乙腈，含体积分数为0.1%的甲酸；B为水，含体积分数为0.1%的甲酸；梯度洗脱：0～60%B 60min，100%B 2min；紫外检测波长：215nm；流速0.2mL／min［12］；样品进样量为10μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI＋）；电喷雾电压3kV；毛细管温度250℃；鞘气（液氮）流速15 arb；毛细管电压18V；温度25℃；扫描模式：FullScan（全扫描）。

2.4 雪卡毒素细胞毒性实验

2.4.1 细胞培养

人神经母细胞瘤用RPMI1640完全培养液（含体积分数15%的胎牛血清）37℃，体积分数5% 的CO2，95%湿度的培养箱中培养。用0.25%－EDTA的胰蛋白酶消化传代［13］。

2.4.2 雪卡毒素提取物的溶液配制

取高纯度雪卡毒素样品0.5mg（用0.5mL乙醇溶解，质量浓度为1mg／mL）。用细胞培养液稀释配成1×105ng／mL，1×104ng／mL，1×103ng／mL，1×102ng／mL，1×101ng／mL，1ng／mL，1×10－1ng／mL的梯度稀释液，待用。

2.4.3 最佳检测波长及接种量的选择

取对数生长期的人神经母细胞瘤细胞，用含体积分数为15%胎牛血清的RPMI1640完全培养液制成不同的细胞悬液后接种入96孔培养板中，200μL／孔。细胞数从高到底依次是4×105个／mL，2×105个／mL，1×105个／mL，5×104个／mL，2.5×104个／mL，1.25×104个／mL，6.25×103个／mL，3.125×103个／mL。每个设5个平行，并以不含细胞的完全培养基孔为空白对照。将细胞培养板置于培养箱中培养24h后，观察细胞状态，待其完全贴壁后，吸出培养液，每孔加入60μL按体积比1∶6稀释的MTT，继续培养4h待孔内形成大量深紫色沉淀。然后吸出培养液，每孔加入100μL DMSO，轻摇溶解其甲臜颗粒。用酶标仪分别在405nm，490nm，630nm 下测定其吸光值［14］。

2.4.4 MTT毒性实验

接种最合适细胞数的人神经母细胞瘤细胞于96孔培养板中，200μL／孔，培养24h待细胞贴壁，每孔加配好的雪卡毒素梯度稀释液10μL，其毒素含量分别为1 000ng，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001 ng，每个剂量设置3个重复孔，每孔再加2μL 10mmol／L乌本苷及2μL 1mmol／L藜芦定。3个只加提取毒素但未加激活剂（乌本苷／藜芦定）对照孔，其毒素剂量为1 000ng。5个只加乌本苷／藜芦定但无毒素的对照孔（10μL培养液代替提取毒素）；5个无毒素及激活剂的非处理对照孔（14μL培养液）。在培养10，15，20h等不同时间，每隔5h用倒置显微镜观察细胞形态。每孔加入60μL按体积比1∶6稀释的MTT，37℃培育4h。吸出培养基，每孔加入100μL DMSO，轻震荡混匀。用酶标仪测定其在490nm下各孔吸光度值。测出OD值后按下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率（%）＝（对照组平均OD值－实验组平均OD值）∕对照组平均OD值×100%

以雪卡毒素提取物质量浓度的对数值（lgC）为横坐标，抑制率为纵坐标画图，可算出IC50值及检测限。

3 结果与分析

3.1 HPLC／MS鉴定雪卡毒素提取物

雪卡毒素快速提取纯化示意图如图2，从250g鱼肝中制得了33.58mg的脂溶性粗提物。经Florisil柱纯化后得到6.3mg提取物，经Sephadex LH－20纯化后收集得到0.8mg雪卡毒素提取物。

图2 雪卡毒素提取纯化流程Fig.2 The extraction and purification process of ciguatoxin

将P－CTX－1标准品与雪卡毒素提取物在波长190～600nm下经双光束紫外可见分光光度计扫描，两者均在215nm处有最大吸收波长。以215nm为检测波长，按2.3节的HPLC条件下梯度洗脱，做雪卡毒素标准品高效液相色谱（图3），可见其在7.17min处出峰。雪卡毒素提取物的高效液相色谱图在7.15min处也有出峰（图4），两者保留时间相同，结果初步说明雪卡毒素提取物中有P－CTX－1存在。

为进一步验证雪卡毒素提取物中有雪卡毒素的存在，使用HPLC／MS扫描后结果（图5和图6）表明在保留时间26.9～28.6min（对应图5中C峰）内有雪卡毒素的分子离子峰［M＋H］＋m／z 1 111.3和钠加和离子［M＋Na］＋m／z1 133.0，与1997年Lewis［15］等从海藻中提取纯化的雪卡毒素P－CTX－1吻合，可以断定提取物中含有P－CTX－1。

图5 雪卡毒素提取物色谱图Fig.5 HPLC of ciguatoxin extracts

图6 雪卡毒素提取物MS图Fig.6 MS of ciguatoxin extracts

3.2 MTT法最佳实验条件的选择

MTT法在波长405nm和630nm下的OD值都很小，不能很好反映不同毒素剂量对细胞毒性影响，而490nm下测定OD值线性很好，最佳检测波长为490nm。如图7随着SK－N－SH细胞数的增加OD值也随之升高，取细胞数量与OD值为线性的区间，确定最合适的接种数量为0.5×104个／孔～4×104个／孔。在该范围内，细胞在孔内贴壁性好，生长密度合适，生长状态良好。

3.3 雪卡毒素提取物对细胞毒性作用

我们利用细胞毒性实验，即利用毒素对细胞的毒性作用检测毒素，进一步验证雪卡毒素提取物中含有雪卡毒素。

雪卡毒素主要作用于神经末梢和中枢神经节，导致神经介质等的释放和神经细胞膜的去极化反应，激活钠离子通道。雪卡毒素大量聚集时由于细胞内钠浓度增高，造成传导受阻。乌本苷、藜芦定激活剂对钠离子内流具有显著增强作用，从而引起细胞内外渗透压的改变，使细胞变圆甚至死亡。活细胞线粒体内有一种琥珀酸脱氢酶，可作用于MTT而产生深紫色产物，因此可根据琥珀酸脱氢酶的活性推知细胞的活性［16－17］。雪卡毒素提取物对细胞作用10h时，观察细胞形态无明显变化，待15h时开始有变化，细胞突触开始收缩，可以看到不同剂量毒素孔细胞死亡状态呈梯度变化。而激活剂对照组（乌本苷／藜芦定）的细胞形态无明显变化。只加毒素未加激活剂的对照组在15h时细胞状态无明显变化，但随着时间延长细胞死亡数在增多。

试验组在作用20h时吸掉培养液，加入预先配好的MTT稀释液。培养4h后490nm下检测其吸光值（图8），结果显示雪卡毒素提取物对SK－N－SH细胞的毒性作用，且有很好的线性关系，IC50为200ng／mL，检测限为0.1ng／mL。虽然神经性贝毒对细胞的作用机理与雪卡毒素作用机理相似，根据现有的认识，神经性贝毒在热带珊瑚鱼体内存在的可能性很小，所以对雪卡毒素检测没有影响。本实验结果与Manger［18］研究的雪卡毒素对小鼠脑神经瘤细胞（Neuro－2A）毒性实验相符，验证了雪卡毒素提取物的神经毒性，并能很好地反映雪卡毒素的毒性大小［19－20］。

图7 细胞数量与OD值之间的关系Fig.7 The curve between the amount of cells and OD values

图8 不同浓度雪卡毒素提取物对细胞毒性Fig.8 The cytotoxicity of different concentrations of ciguatoxin extract

4 结 论

在优化了提取、纯化基础之上，建立一种从石斑鱼肝脏内快速提取纯化雪卡毒素的方法，与以往的提纯雪卡毒素方法相比，首先在原材料上具有毒素含量较高的优点。雪卡毒素在鱼体内不是均匀分布的，通常在于内脏、生殖腺的鱼卵中含量很高，而在肌肉和骨骼中相对较低。类似可见新西兰鲷鱼肝脏中的毒素含量比肌肉高50倍，而海鳝肝脏中的毒素含量比肌肉高达100倍［21］。

其次在提取纯化步骤上做了改进，每一步都做到尽量增大对雪卡毒素的提取效率，制得了纯度较高的提取物。Florisil柱增大了对杂质的去除，对雪卡毒素的纯化很有用，提取物到过柱后颜色变淡可以明显看出去杂效果，但样品的损失也会相对大些，研究中将进一步考虑使用体积小些的固相萃取柱。

本研究建立的提取纯化雪卡毒素方法具有原料来源好，操作步骤少，简单易行等优点。所得纯化物在HPLC的保留上与标准品一致，利用HPLC／MS和细胞毒性试验鉴定所提取的样品中有P－CTX－1存在，比传统的利用小鼠生物法检测雪卡毒素相比，具有更加灵敏、全面及能准确分析毒素成分的优点，同时在国内首次证明了P－CTX－1在广东沿海石斑鱼体中存在。进一步的研究应通过提高纯化工艺，得到更高纯度的雪卡毒素。可以考虑用制备型高效液相色谱和膜分离技术。

（References）：

［1］ LEWIS R J，SELLIN M，MARK A，et al.Purification and characterization of ciguatoxins from moray eel（Lycodontis javanicus，Muraenidae）［J］.Toxicon，1991，29（9）：1115－1127.

［2］ LIAO Q X，YUAN J H，ZHAO S Q，et al.Analysis of food poisoning due to ciguatoxin in Shenzhen from 2004to 2006［J］.Lingnan Journal of Emergency Medicine，2007，12（3）：218－219.廖庆祥，袁建辉，赵肃清，等.2004～2006年深圳市雪卡毒素食物中毒事件分析［J］.岭南急诊医学杂志，2007，12（3）：218－219.

［3］ ZHAO S Q，ZHANG K，FANG Y X，et al.Review of cigutoxin poisoning and survey on its determination［J］.South China Fisheries Science，2006，2（2）：68－70.赵肃清，张焜，方岩雄，等.雪卡毒素中毒的现状及检测分析概况［J］.南方水产，2006，2（2）：68－70.

［4］ WONG C K，PATRICIA H，KELLIE L H，et al.Solid－phase extraction clean－up of ciguatoxin－contaminated coral fish extracts for use in the mouse bioassay［J］.Food Additives and Contaminants，2009，26（2）：236－247.

［5］ LEWIS R J，YANG A J，JONE A，et al.Rapid extraction combined with LC－tandem mass spectrometry（CREM－LC／MS／MS）for the determination of ciguatoxins in ciguateric fish flesh［J］.Toxicon，2009，54（1）：62－66.

［6］ HAMILTON B，HURBUNGS M，JONES A，et al.Multiple ciguatoxins present in Indian Ocean reef fish［J］.Toxicon，2002，40（9）：1347－1353.

［7］ JIANG F X.Do you know what is ciguatoxin？［J］.China Food，1995，（7）：8.蒋福祥.你知道雪卡毒素吗？［J］.中国食品，1995，（7）：8.

［8］ POTTIER I，VERNOUX J P，JONES A，et al.Characterisation of multiple Caribbean ciguatoxins and congeners in individual specimens of horse－eye jack（Caranx latus）by high－performance liquid chromatography／mass spectrometry［J］.Toxicon，2002，40（7）：929－939.

［9］ LABROUSSE H，MATILE L.Toxicological biotest on Diptera larvae to detect ciguatoxins and various other toxic substances［J］.Toxicon，1996，34（8）：881－891.

［10］ BOTTEIN D M，WANG Z H，RAMSDELL J S.Optimization of ciguatoxin extraction method from blood for Pacific ciguatoxin（PCTX－1）［J］.Toxicon，2007，49（1）：100－105.

［11］ HAMILTON B，HURBUNGS M，VERNOUX J P，et al.Isolation and characterisation of Indian Ocean ciguatoxin［J］.Toxicon，2002，40（6）：685－693.

［12］ LEWIS R J，JONES A ，VERNOUX J P，et al.HPLC／tandem electrospray mass spectrometry for the determination of Sub－ppb levels of Pacific and Caribbean ciguatoxins in crude extracts of fish［J］.Anal.Chem.，1999，71（1）：247－250.

［13］ CAILLAUD A，CNETE E，IGLESIA P D，et al.Cell－based assay coupled with chromatographic fractioning：a strategy for marine toxins detection in natural samples［J］.Toxicol in Vitro，2009，23（8）：1591－1596.

［14］ ZHENG L，ZHU H，GUO A Z，et al.Journal of Huazhong Agricultural University，2007，26（4）：502－506.郑露，朱海，郭爱珍，等.西加毒素细胞毒性检测方法的建立［J］.华中农业大学学报，2007，26（4）：502－506.

［15］ LEWIS R J，JONES A.Characterization of ciguatoxins and ciguatoxin congeners present in ciguateric fish by gradient reverse－phase high－performance liquid chromatography／mass spectrometry［J］.Toxicon，1997，35（2）：159－168.

［16］ YANG C X，CHEN W R.Detection of toxic effect of Acrylamine on neuron by using MTT［J］.Journal of Shanghai Tiedao University，1998，19（1）：8－10.杨翠香，陈婉蓉.MTT法检测丙烯酰胺对神经细胞毒性作用［J］.上海铁道大学学报，1998，19（1）：8－10.

［17］ ZHAO B，GE J F，ZHU J J，et al.The discussion of the method of calculating the inhibition rate of IC50in the MTT assay.Anhui Medical and Pharmaceutical，2007，11（9）：834－836赵斌，葛金芳，朱娟娟，等.小议在 MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法［J］.安徽医药，2007，11（9）：834－836.

［18］ MANGER R L，LEJA L S，LEE S Y，et al.Tetrazolium－based cell bioassay for neurotoxins active on voltage－sensitive sodium channels：semiautomated assay for saxitoxins，brevetoxins，and ciguatoxins［J］.Anal.Biochem.，1993，214（1）：190－194.

［19］ LEWIS R J.Detection of ciguatoxins and related benthic dinoflagellate toxins：in vivo and in vitro methods［M］∥HALLEGRAEFF G M，ANDERSON D M，CEMBELLA A D.Manual on harmful marine microalgae.Paris：IOC Manuals and Guides UNESCO，1995：135－161.

［20］ BOYDRON L，BENOIT E，SAUVITE M P，et a1.Detection of ciguatoxins：advantages and drawbacks of different biological methods［J］.J.Soc.Biol.，2005，199（2）：115－125.

［21］ FOUW J C，EGMOND H P，SPEIJERS G J A.Ciguatera fish poisoning：a review ［R］.RIVM Report No.388802021，1999，Bilkhoven：The National Intitute for Public Health and the Enviornment.

（高 峻 编辑）

Preliminary Study on Extraction and Purification of Ciguatoxin

YAN Hong－peng，ZHANG Cai－xia，ZHAO Su－qing，ZHANG Kun
（Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，China）

Ciguatoxin is a kind of neurotoxic marine algal toxins.However，ciguatoxin in high purity is the material foundation for related research.In this paper，ciguatoxin was extracted from Epinephelussp liver and purified by Florisil and Sephadex LH－20chromatography.Furthermore，this ciguatoxin was identified as Pacific ciguatoxin（P－CTX－1）by high－performance liquid chromatography／mass spectrometry（HPLC／MS）and cytotoxicity assay.This ciguatoxin has the same retention time comparing to the reference compound P－CTX－1in HPLC.The mass spectra of this ciguatoxin showed the mass peaks of 1 111.3（［M＋H］＋）and 1 133.0（［M＋Na］＋），which was fully consistent with the reported mass peaks of P－CTX－1.The cytotoxicity of ciguatoxin on the human neuroblastoma cell（SK－N－SH ）was determined by MTT assay，and the results indicated a linear dose－dependent inhibition effect of ciguatoxin on proliferation of the cells.The cytotoxicity assay further confirmed it as ciguatoxin in high purity.

ciguatoxin；extraction；purification；HPLC／MS；MTT

January 18，2011

P734.4

A

1671－6647（2012）03－0408－08

2011－01－18

国家自然科学基金 ——雪卡毒素单链抗体的量子点标记及滤量分析方法研究（20872020）和单链抗体绿色荧光触合蛋白为基础的雪卡毒素检测方法研究（20672023）；广东省自然科学基金——量子点标记雪卡毒素单链抗体及痕量分析方法研究（8251009001000005）

闫鸿鹏（1986－），男，河南安阳人，硕士，主要从事海洋生物毒素方面研究.E－mail：hong8peng8@163.com

＊通讯作者，教授，E－mail：suqingzhao@yahoo.com