结肠癌中MMP-11和Moesin mRNA的表达与肿瘤转移及预后的关系

张丽萍 蒲红伟 陈 晓 李晓梅 竞花兰 刘小山*

(1.新疆医科大学基础医学院生化教研室，乌鲁木齐830011;2.新疆医科大学高职学院中心实验室，乌鲁木齐830011;3.中山大学中山医学院法医学教研室，广州510080)

结肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是胃肠道中常见的恶性肿瘤之一，其发生率在我国居全部恶性肿瘤的第4位，且近20年来发生率在持续上升［1］。结肠癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段的过程，研究［2-4］表明基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)和膜突蛋白(Moesin)在这个过程中起着非常重要作用，参与了肿瘤演进的多种病理过程。本研究通过检测结肠癌组织中MMP-11和Moesin基因的表达情况，并探讨二者在结肠癌发生、发展过程中的作用。

1 资料和方法

1.1 组织标本

选取新疆医科大学第一附属医院病理科1998～2004年手术切除的结肠癌石蜡包埋组织68例，其中男性35例，女性33例，患者年龄28～81岁，平均年龄62岁;正常组织40例为手术切端距癌组织5cm以上、经组织学检查证实的正常结肠黏膜。所有病例手术前均未接受化疗、放射治疗或免疫治疗，术后予以辅助化疗，临床资料完整。

1.2 方法

采用原位杂交法检测MMP-11和Moesin mRNA的表达，检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;所有手术切除标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋后行4 μm连续切片，HE染色;原位杂交染色按试剂盒说明书操作，光镜观察时用已知阳性结肠癌切片作阳性对照，0.01 mol/L PBS(pH7.4)代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判断

MMP-11和Moesin mRNA表达均以细胞胞质内呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，且其着色强度高于背景非特异性染色。每例切片随机选取5个高倍视野进行结果判断，按染色强度及阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比综合计分。结肠癌癌细胞阳性判定标准参照，分级方法如下:染色强度:不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞数:小于5%为0分，5% ～25%为1分，26%～50%为2分，大于50%为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，0分记为阴性(-)，1～3分记为弱阳性(+)，4～5分记为中度阳性(++)，大于或等于6分记为强阳性(+++)，进行统计学分析时(+～+++)皆为阳性。随访采取电话问询，生存时间从手术日开始计算，末次随访为2009年9月。

1.4 统计学方法

应用SPSS13.0软件包进行分析，采用 Kaplan-Meier法评估患者术后5年生存率，率的比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-11和Moesin mRNA在结肠癌组织和正常肠黏膜中的表达

MMP-11 mRNA在结肠癌组织中的阳性表达率为69.1%(47/68)，高于在正常结肠黏膜中的阳性表达率12.5%(5/40)(表1);Moesin mRNA在结肠癌组织中的阳性表达率60.3%(41/68)亦高于正常结肠黏膜中的阳性表达率10%(4/40)(图1、2)。

图1 MMP-11 mRNA在结肠癌细胞胞质中的表达Fig.1 Expression of MMP-11 mRNA in the cytoplasm of colorectal cancer

图2 Moesin mRNA在结肠癌细胞胞质中的表达Fig.2 Expression of Moesin mRNA in the cytoplasm of colorectal cancer

2.2 MMP-11和Moesin mRNA在结肠癌组织中的表达与临床病理的关系

对68例患者结肠癌组织中MMP-11和Moesin mRNA表达和临床病理特征分析发现，Moesin mRNA在性别、年龄、民族、肿瘤大小、Dukes'分期、浸润深度的表达差异无统计学意义(P＞0.05);在组织分化程度、淋巴结转移、临床分期的表达差异有统计学意义(P＜0.05);MMP-11 mRNA在性别、年龄、民族、肿瘤大小、Dukes'分期的表达差异无统计学意义(P＞0.05);在组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期的表达差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表1 MMP-11和Moesin mRNA在正常结肠黏膜及结肠癌组织中的表达Tab.1 Expression of MMP-11 and Moesin mRNA in the normal colorectal mucosa and in colorectal cancer tissue n(%)

表2 MMP-11和Moesin mRNA在结肠癌组织中的表达与临床病理的关系Tab.2 Relationship between expression of MMP-11 and Moesin mRNA in colorectal cancer tissue and the clinical pathology n(%)

2.3 MMP-11和Moesin mRNA在结肠癌中的表达与预后的关系

在对68例结肠癌患者随访中因电话变更，有9例失访，其余59例中MMP-11 mRNA阳性表达的患者5年生存率为46.8%，阴性者5年生存率75%，2者差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 MMP-11和Moesin mRNA在结肠癌中的表达与预后的关系Tab.3 Relationship between expression of MMP-11 and Moesin mRNA in colorectal cancer and the prognosis n(%)

MMP-11阳性表达组与阴性表达组相比，前者5年生存率较高且差异有统计学意义(P＜0.05);Moesin阳性表达组平均生存时间和中位生存时间都高于阴性表达组，但差异无统计学意义(P＞0.05)(见图5，6)。

图5 MMP-11 mRNA表达组生存曲线Fig.5 Survival curves of the positive and negative expression groups of MMP-11 mRNA

图6 Moesin mRNA表达组生存曲线Fig.6 Survival curves of the positive and negative expression groups of Moesin mRNA

3 讨论

浸润和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，肿瘤的转移是一个比较复杂的过程，涉及肿瘤细胞的脱落、新生血管的长入及对细胞外基质的降解等［5］。在组织学上，细胞基底膜完整性的破坏被认为是恶性肿瘤浸润开始的一个标志。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类生物活性依赖于锌离子、有降解细胞外基质能力的内肽酶家族［6］，在体内主要参与细胞外基质的降解或重构、炎性反应、缺血缺氧损伤等各种生理及病理过程［7］。MMP-11是基质金属蛋白酶(MMPs)家族的成员之一，定位于染色体22q11.23，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，能降解细胞外基质和基底膜，可以导致细胞外基质代谢平衡的失调，从而引发肿瘤的浸润和转移［8］。对人体多种肿瘤进行的研究［9］表明，在不同实体瘤中MMP-11有不同程度的增高，与肿瘤进展及预后相关。Schuetz C S等［10］通过配对分析9例乳腺原位癌和浸润性癌，认为MMP-11是乳腺癌浸润相关基因之一。Gonzalez L O等［11］证实MMP-11过表达与乳腺癌的发生、发展有重要关系。Deng H等［12］通过质粒转染的方法证实了MMP-11在胃癌中参与肿瘤细胞的增生和肿瘤的发展。Zhao Z S等［13］研究结果证实MMP-11 mRNA和蛋白水平在胃癌组织中均呈现出高表达，在进展期胃癌患者中表达更明显。严冬等［14］对130例胃癌患者血清，采用RT-PCR及酶联免疫技术检测MMP-11 mRNA及蛋白表达情况，结果显示MMP-11 mRNA在胃癌患者外周血清中阳性表达率(68.4%)高于正常人群(5%)，尤其在根治术后转移和(或)复发的晚期患者的外周血中，推测其可能作为胃癌诊断、复发及转移的分子标志物。

膜突蛋白(Moesin)属 ERM(Ezrin，Radixin，Moesin)家族成员，表达Moesin分子的cDNA核苷酸长度为3 835个碱基，开放读码框内有1 731个碱基编码577个氨基酸。Moesin蛋白存在两种构象，激活的Moesin蛋白(磷酸化)作为桥梁分子，介导肌动蛋白与质膜的交联从而引发肌动蛋白骨架的重构，促进细胞生长、迁移，所以Moesin蛋白在肿瘤发生、浸润及转移过程中扮演着重要角色。已有研究［15］证明Moesin的表达程度与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移和分化程度有关。Kim C Y等［16］也证实Moesin在结肠癌侵袭与转移过程起重要作用，可作为结肠癌的诊断与判断预后的生物标志。周勤等［17］采用免疫组化法检测31例正常宫颈组织(NCE)、48例宫颈上皮内瘤样变(CIN)及66例宫颈鳞癌组织(SCC)中Moesin表达，其表达水平显著升高，在CIN组Moesin的表达随病变程度加重而升高，且SCC组中与分期、浸润深度、盆腔淋巴转移有关。刘畅等［18］认为甲状腺乳头状癌组织中Moesin的高表达与肿瘤的侵袭和转移有关。

本研究利用原位杂交方法对结肠癌组织中Moesin和MMP-11 mRNA表达情况进行了研究，实验结果显示Moesin和MMP-11 mRNA在结肠癌阳性表达率分别为60.3%和69.1%，明显高于正常结肠黏膜组织，差异有统计学意义。其中Moesin mRNA表达与性别、年龄、民族、肿瘤大小、Dukes'分期、浸润深度无关，与组织分化程度、淋巴结转移、临床分期表达有关，该结果与李莹杰等［19-20］在胃癌中的研究结果相符。MMP-11 mRNA表达与性别、年龄、民族、肿瘤大小、Dukes'分期差异无统计学意义(P＞0.05)，与组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期表达有统计学意义，组织分化差、有淋巴结转移和临床分期高者MMP-11 mRNA表达率高，提示MMP-11在结肠癌中的表达随Dukes分期增高而增加，在结肠癌的进展和分化过程中，分化程度越低，肿瘤细胞分泌MMP-11越多，其浸润和转移能力也越强，在肿瘤的浸润及转移中发挥着至关重要的作用，研究结果与Gonzalez L等［21］结果一致，因此本研究认为 MMP-11和 Moesin可以作为结肠癌浸润和转移的预测指标;此外研究通过生存率分析结果显示MMP-11 mRNA阳性表达的肿瘤患者5年生存率明显低于阴性者，差异有统计学意义，提示MMP-11可以作为结肠癌判断预后的生物学指标，而Moesin对结肠癌的预后影响还有待进一步研究。

综上所述，Moesin和MMP-1 mRNA在结肠癌中均高表达且与临床病理相关，提示上述生物学指标与临床病理学指标相结合可能为结肠癌的诊断、病情监测、预后判断以及治疗提供了崭新的思路。

［1］Gellad Z F，Provenzale D.Colorectal cancer:National and international perspective on the burden of disease and public health impact［J］.Gastroenterology，2010，138(6):2177-2190.

［2］Takeuchi T，Adachi Y，Nagayama T，et al.Matrix metalloproteinase-11 overexpressed in lobular carcinoma cells of the breast promotes anoikis resistance［J］.Virchows Arch，2011，459(3):291-297.

［3］Schlecht N F，Brandwein-Gensler M，Smith R V，et al.Cytoplasmic ezrin and moesin correlate with poor survival in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Head Neck Pathol，2012，6(2):232-243.

［4］Yan D，Dai H，Liu J W.Serum levels of mmp-11 correlate with clinical outcome in chinese patients with advanced gastric adenocarcinoma［J］.BMC Cancer，2011，11:151-157.

［5］Chan A O，Chu K M，Lam S K，et al.Early prediction of tumor recurrence after curative resection of gastric carcinoma by measuring soluble e-cadherin［J］.Cancer，2005，104(4):740-746.

［6］Wang X，Li K F，Adams E，et al.Matrix metalloproteinase inhibitors:A review on bioanalytical methods，pharmacokinetics and metabolism［J］.Curr Drug Metab，2011，12(4):395-410.

［7］Pearce E，Tregouet D A，Samnegard A，et al.Haplotype effect of the matrix metalloproteinase-1 gene on risk of myocardial infarction［J］.Circ Res，2005，97(10):1070-1076.

［8］Roy R，Yang J，Moses M A.Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human cancer［J］.J Clin Oncol，2009，27(31):5287-5297.

［9］Orlichenko L S，Radisky D C.Matrix metalloproteinases stimulate epithelial-mesenchymal transition during tumor development［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25(6):593-600.

［10］Schuetz C S，Bonin M，Clare S E，et al.Progression-specific genes identified by expression profiling of matched ductal carcinomas in situ and invasive breast tumors，combining laser capture microdissection and oligonucleotide microarray analysis［J］.Cancer Res，2006，66(10):5278-5286.

［11］Gonzalez L O，Pidal I，Junquera S，et al.Overexpression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in mononuclear inflammatory cells in breast cancer correlates with metastasis-relapse［J］.Br J Cancer，2007，97(7):957-963.

［12］Deng H，Guo R F，Li W M，et al.Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，326(2):274-281.

［13］Zhao Z S，Chu Y Q，Ye Z Y，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase 11 in human gastric carcinoma and its clinicopathologic significance［J］.Hum Pathol，2010，41(5):686-696.

［14］严冬，沈琳，吕尤勇，等.MPP-11在胃癌患者血清中的表达及临床意义［J］.中国癌症杂志，2007，17(12):968-972.

［15］Wang C C，Liau J Y，Lu Y S，et al.Differential expression of moesin in breast cancers and its implication in epithelialmesenchymal transition［J］.Histopathology，2012，61(1):78-87.

［16］Kim C Y，Jung W Y，Lee H J，et al.Proteomic analysis reveals overexpression of moesin and cytokeratin 17 proteins in colorectal carcinoma［J］.Oncol Rep，2012，27(3):608-620.

［17］周勤，邓婷.宫颈鳞癌中膜突蛋白及CD105的表达及其临床意义［J］.实用妇产科杂志，2011，27(2):106-109.

［18］刘畅，高政南，刘忠，等.Ezrin和 Moesin在甲状腺乳头状癌中的相关性研究［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2011，18(10):559-560.

［19］李莹杰，陶晓峰，贺岩，等.Ezrin和Moesin在胃癌中的表达及其临床意义［J］.中国肿瘤，2007，6(7):550-552.

［20］任庆华.膜一细胞骨架连接分子Ezrin及CD44v6对胃癌生长和转移的影响［D］.沈阳:中国医科大学，2010.

［21］Gonzalez L，Eiro N，Gonzalez L O，et al.Effect of the expression of matrix metalloproteases and their tissue inhibitors on survival of patients with resectable colorectal cancer［J］.Dig Dis Sci，2012，57(8):2063-2071.