叶酸和维生素B12对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞的保护作用

张景燕 陈 娟 王 蓉 赵静姝 吴燕川

(首都医科大学宣武医院中心实验室神经变性病教育部重点实验室北京老年病医疗研究中心，北京100053)

老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)是一种以进行性认知功能损害和记忆力减退为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。随着人口老龄化不断加剧，AD的发病率和患病率逐年增加，研究如何防治AD、降低发病率势在必行［1］。Piazza等［2］认为机体内同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)增高可致神经细胞毒性，是诱发AD的因素之一，而Hcy是含硫的氨基酸，需要通过人体必需氨基酸甲硫氨酸(Hcy的唯一前体)代谢脱去甲基后形成。体内Hcy浓度受到各种因素的影响，最常见的如饮食中叶酸和维生素B12缺乏，即可引起Hcy浓度增高，从而导致AD的发生［3］。本实验拟通过观察叶酸和维生素B12对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞的影响，探讨叶酸和维生素B12对神经细胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1)细胞株:人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞来自瑞典卡罗琳斯卡医学院。

2)试剂:叶酸和维生素B12系SIGMA-ALDRICH公司产品。MTT〔噻唑蓝，3-(4，5-dimethylthyl thiazo-l 2-yl)-2，5diphenyltetrazolium broide〕系 Sigma公司产品。二甲基亚砜(DMSO)系北京亚太精细化工公司产品。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂系北京森美希康试剂公司产品。

1.2 方法

1)细胞培养:用含10%胎牛血清的MEM培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养，6 d传代1次，中间换液1次。

2)MTT代谢率测定:将生长良好、传代稳定的SH-SY5Y细胞以1×104/mL的密度接种于96孔板(Nunc产品)，每孔体积200 μL，48 h后分为4组进行实验。包括:对照组、叶酸组、维生素B12组、叶酸+维生素B12组，各组细胞数及培养液体积均相等，于接种后第3天，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，37℃孵育4 h，吸出培养液，每孔加入 DMSO 200 μL，振摇 10 min，用全波长酶标仪(multiskan spectrum)测定550 nm处吸光度值(A)。

3)LDH漏出率测定:将SY5Y细胞以1×104/mL的密度接种于48孔板，每孔体积500 μL，48 h后分组(同MTT代谢率测定)。于接种后第3天留取各组细胞培养液，用日立7170生化分析仪进行酶法测定。

4)细胞计数:将细胞密度调整为1×104/mL的密度接种于48孔板，每孔体积500 μL，48 h后分组(同MTT代谢率测定)。于接种后3 d对各组细胞进行计数。

5)培养细胞形态观察:倒置显微镜下观察培养的细胞，比较实验组和对照组细胞的形态。

1.3 统计学方法

应用SPSS 11.5统计软件，计量数据用均数±标准差(±s)表示，进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT代谢率测定

MTT检测结果显示，叶酸组、维生素B12组、叶酸+维生素B12组可使SH-SY5Y细胞MTT代谢率升高，线粒体活性增强，与对照组相比，P＜0.05，差异有统计学意义(表1)。

表1 叶酸、维生素B12、叶酸+维生素B12对SH-SY5Y细胞MTT代谢率的影响Tab.1 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the metabolic rate in SH-SY5Y

2.2 LDH漏出率测定

用酶法测定的LDH漏出率结果显示，与对照组相比，叶酸组、维生素B12组、叶酸+维生素B12组SH-SY5Y细胞LDH漏出率降低，说明细胞死亡率降低，差异有统计学意义(P＜0.05)(表2)。

表2 叶酸、维生素B12、叶酸+维生素B12对SH-SY5Y细胞LDH漏出率的影响Tab.2 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the LDH leakage rate in SH-SY5Y

2.3 细胞计数

细胞计数结果显示，SH-SY5Y细胞中分别加入叶酸、维生素B12以及叶酸和维生素B12共同作用后，细胞计数明显高于对照组，进行数据比较后差异具有统计学意义(P＜0.05)(表3)。

表3 叶酸、维生素B12、叶酸+维生素B12对SH-SY5Y细胞计数的影响Tab.3 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the cell count in SH-SY5Y

3 讨论

叶酸又称蝶酰谷氨酸，是B族维生素，由喋啶核、对氨苯甲酸及谷氨酸三部分组成，人体不能自行合成，叶酸在体内可转变成叶酸的活性型四氢叶酸。维生素B12也属B族维生素，在叶酸的代谢中必不可少，并且都是同型半胱氨酸(Hcy)合成蛋氨酸的辅酶。叶酸能够促进神经系统的正常发育，在调控神经生成和程序性细胞死亡中起重要作用。

由于机体内Hcy浓度与叶酸和维生素B12的水平呈负相关［4-5］，当叶酸和维生素B12在体内的水平降低时，Hcy浓度增高，对神经细胞产生毒性作用，导致细胞凋亡和DNA损伤，从而增加老年性痴呆患病的风险。老年人的日常饮食摄入量较少，可能造成各种营养包括叶酸和维生素B12的缺乏［6-7］，从而影响Hcy的代谢转化，如果能够及时的补充营养，尤其是B族维生素(叶酸和维生素B12)可以加强Hcy的代谢，降低血Hcy的含量［8-13］，减缓老年人认知功能的减退，对预防AD起到积极防治作用，同时，补充叶酸、维生素B12简单易行，能够让老年群体接收。本实验证明，叶酸、维生素B12对于神经细胞确实存在保护作用，尤其是二者合用效果更为明显，能够增加细胞的生长代谢，减少细胞死亡，此结果为通过补充叶酸、维生素B12保护神经元、预防AD提供了基础实验依据。

总之，本研究通过观察叶酸、维生素B12对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞的作用，从细胞水平上研究了叶酸、维生素B12对神经细胞的保护作用，对于临床上防治AD具有参考意义。

［1］Alzheimer’s Association.2009 Alzheimer’s disease facts and figures［J］.Alzheimers Dement，2009，5(3):234-270.

［2］Piazza F，Galimberti G，Conti E，et al.Increased tissue factor pathway inhibitor and homocysteine in Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2012，33(2):226-233.

［3］Sinha M，Saha A，Basu S，et al.Aging and antioxidants modulate rat brain levels of homocysteine and dehydroepiandrosterone sulphate(DHEA-S):implications in the pathogenesis of Alzheimer’s disease［J］.Neurosci Lett，2010，483(2):123-126.

［4］马启信，朱爱琴，于梅花.高同型半胱氨酸血症对高海拔地区阿尔茨海默病影响的观察［J］.高原医学杂志，2009，19(2):24-26.

［5］Kale A，Naphade N，Sapkale S，et al.Reduced folic acid，vitamin B12 and docosahexaenoic acid and increased homocysteine and cortisol in never-medicated schizophrenia patients:Implications for altered one-carbon metabolism［J］.Psychiatry Res，2010，175(1-2):47-53.

［6］Zhu Y，He Z Y，Liu H N.Meta-analysis of the relationship between homocysteine，vitamin B12，folate，and multiple sclerosis［J］.J Clin Neuroscience，2011，18(7):933-938.

［7］Smach M A，Naffeti S，Charfeddine B，et al.Homocysteine，vitamin B-12，folic acid and the cognitive decline in the elderly［J］.Pathol Biol，2012(in press).

［8］Wald D S，Kasturiratne A，Simmonds M.Serum homocysteine and dementia:Meta-analysis of eight cohort studies including 8669 participants［J］.Alzheimers Dement，2011，7(4):412-417.

［9］Koike T，Kuzuya M，Kanda S，et al.Raised homocysteine and low folate and vitamin B-12 concentrations predict cognitive decline in community-dwelling older Japanese adults［J］.Clin Nutr，2008，27(6):865-871.

［10］蒋安杰，方芳，晏勇，等.阿尔茨海默病和血管性痴呆患者血浆同型半胱氨酸和胆碱酯酶水平及其临床意义探讨［J］.重庆医学，2010，39(12):1530-1532.

［11］商秀丽，张凤英，孟令慧，等.阿尔茨海默病患者血尿酸水平的检测及意义［J］.中国医科大学学报，2009，38(5):333-334.

［12］张玉杰，李淑娟，关明，等.高同型半胱氨酸型高血压与急性脑梗死的相关性分析［J］.中国脑血管病杂志，2011，8(12):637-640.

［13］Haghdoost-Yazdia H，Fraidounib N，Faraji A，et al.High intake of folic acid or complex of B vitamins provides anti-Parkinsonism effect:No role for serum level of homocysteine［J］.Behavioural Brain Research，2012，233(2):375-381.