两种髓鞘染色方法在Cuprizone诱导脱髓鞘小鼠模型中的比较

张 丽 尹琳琳 李 林

(首都医科大学宣武医院药物研究室神经变性病教育部重点实验室，北京100053)

多发性硬化是一种慢性中枢神经系统脱髓鞘疾病，其病理表现为神经纤维出现髓鞘变性、脱失和轴突变性等［1］。髓鞘是包裹在有髓神经纤维轴突外的脂质细胞膜，呈管状结构，为阶段性，其主要成分为类脂质和蛋白质［2］。双环己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)是一种选择性铜离子螯合剂，小剂量能够诱导中枢神经系统髓鞘脱失［3］，形成髓鞘细胞的少突胶质细胞死亡［4］，常作为诱导因子建立脱髓鞘动物模型。髓鞘染色在病理诊断和研究中具有重要意义。本研究应用Cuprizone诱导脱髓鞘小鼠模型，取脑后切片，分别以牢固蓝(Luxol Fast Blue，LFB)和油红O两种染色方法观察脑组织纹状体和海马2个断面胼胝体髓鞘脱失状况，比较染色方法的优劣，为研究者提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型建立

6周龄C57BL/6系小鼠，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔合格证号:SCXK(京)2006-0009〕，饲养于SPF级实验室，自由进食饮水。小鼠采用抽签法随机分为对照组和模型组(n=3):对照组动物采用正常饲料饲育;模型组用含0.2%Cuprizone粉末的饲料饲育4周。

1.2 药品与试剂

Cuprizone、油红O、牢固蓝购自Sigma公司。10%水合氯醛、0.9%氯化钠注射液等由首都医科大学宣武医院制剂室提供。氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、多聚甲醛、蔗糖等购自北京化学试剂公司。

1.3 主要仪器

冰冻切片机(Thermo公司，美国);生物显微镜(Olympus公司，日本)。

1.4 取材

动物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取脑组织放入含有30%蔗糖和4%多聚甲醛固定液中，沉降后再换一次固定液即可。

1.5 牢固蓝(LFB)髓鞘染色法［5］

取脑组织，行连续冠状面冰冻切片，片厚20 mm，各组取相同平面。将脑片置于0.1%LFB/95%乙醇溶液中避光浸染过夜;95%乙醇漂洗3次，去除表面多余染料;0.05%碳酸锂水溶液内分化;充分水洗;苏木素染色1 min，盐酸乙醇适度分色，自来水返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，封片。

1.6 油红O髓鞘染色法［6］

取0.5%油红O/异丙醇储存液与蒸馏水按3∶2比例混匀，静置10 min后过滤。将组织切片置于预先配制好的油红O染液中10～15 min，60%乙醇分色，在Harris苏木精染液中淡染30 s，盐酸、乙醇适度分色，每步之间用水冲洗，镜检。捞片后室温中放置稍干，甘油明胶封片。

2 结果

2.1 小鼠脑组织纹状体切面牢固蓝(LFB)与油红O髓鞘染色结果

油红O染色将正常对照组小鼠脑组织纹状体断面胼胝体染成红色，与皮质和纹状体分界清晰(图1A1)，Cuprizone模型组因髓鞘脱失，大量炎性细胞浸润染成蓝紫色(图1B1)。牢固蓝染色将正常对照组脑组织纹状体断面胼胝体染成亮蓝色(图1A2)，模型组残存髓鞘染成蓝色，炎性细胞为蓝紫色，但与周围组织分界不明显(图1B2)。

图1 小鼠脑组织纹状体断面牢固蓝与油红O髓鞘染色Fig.1 Striatum section Luxol Fast Blue and oil red O staining in mouse(100×)

2.2 小鼠脑组织海马切面牢固蓝(LFB)与油红O髓鞘染色

在小鼠脑组织海马切面，牢固蓝(LFB)与油红O 2种髓鞘染色均可以清晰显示胼胝体膝部和扣带病理改变。正常对照组胼胝体分别呈红色(油红O染色，图2A1)和亮蓝色(牢固蓝染色，图2A2);Cuprizone模型组胼胝体髓鞘脱失严重，残存髓鞘分别染成淡红色(油红O染色，图2B1)和淡蓝色(牢固蓝染色，图2B2)，以膝部尤为明显(箭头所示)。

图2 小鼠脑组织海马断面牢固蓝与油红O髓鞘染色Fig.2 Brain hippocampus section Luxol Fast Blue and oil red O staining in mouse(100×)

3 讨论

脱髓鞘疾病是以神经髓鞘脱失为主要或始发病变的神经系统疾病，可发生于中枢神经系统或周围神经系统，如多发性硬化、弥漫性硬化、急性播散性脑脊髓炎等。此类疾病主要累及脑深部白质、脑室等部位，磁共振(MRI)扫描信号异常［7］。Cuprizone动物模型的病理表现为白质髓鞘含量下降、轴索消失、少突胶质细胞变性、炎性细胞浸润等［8］;电镜观察发现白质内髓鞘结构分离和断裂、线粒体肿胀变性等超微结构改变［9］。

牢固蓝(LFB)染色是脂溶性染料浸染法的一种，也是检测中枢神经系统白质变化的常用方法。Luxol是国际上认可的髓鞘染色剂，主要依据其在乙醇溶液内可与髓鞘磷脂结合染色的特点，利用组织灰白质在乙醇和碳酸锂中对牢固蓝结合力度不同，将灰质染成淡蓝色，白质染成亮蓝色，借助色差区分灰质与白质的界限。LFB方法常复染苏木素以显示组织结构，细胞核染成蓝紫色［10］。本实验中，在海马冠状面切片染色中，正常对照组胼胝体的髓鞘呈亮蓝色，与皮质、海马分界清晰，髓鞘及组织结构易于观察;在纹状体断面，正常对照组层次清晰。但是，Cuprizone模型组因髓鞘大量丢失，炎性细胞浸润，经苏木素复染后，胼胝体部位蓝紫色细胞核与牢固蓝的亮蓝色界限不明显。油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂。脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置入染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红色。本实验中，无论是海马切面还是纹状体切面，经油红O染色后均可将胼胝体与周围结构清晰区分，红色亮丽，与组织背景对比明显。

在Cuprizone诱导的脱髓鞘小鼠模型中，通过牢固蓝(LFB)与油红O两种髓鞘染色方法比较发现，两种方法均可特异性地将海马切面的胼胝体部位清晰区分，界限明显，对神经髓鞘具有良好的标记作用;但在纹状体切面油红O法能更明显区分周围组织结构。切片经牢固蓝染色后可通过二甲苯透明、中性树胶封片的步骤，适于长期保存，但有些部位染色界限不够明显;而油红O染色可避免此问题。配制油红O染液的异丙醇易挥发，对人体健康有害，染液产生沉淀，用前需过滤，每次染色时新鲜配制［11］;组织染色后需待略干后用甘油明胶封片，应小心操作，避免组织结构被破坏或有皱褶，影响镜下观察。

总之，牢固蓝(LFB)与油红O两种髓鞘染色方法具有操作简单、特异性好、易于掌握等特点，是神经系统脱髓鞘等疾病可靠的实验方法，临床及实验室可根据实际工作需要选择。

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