仙人掌浸提液对铜绿微囊藻生长的影响

薛维纳，彭岩波，陈阳

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101;2.山东省环境保护科学研究设计院，山东 济南 250013;3.山东省环境保护厅，山东 济南 250012)

0 引言

随着城市化、工业化进程加快，以及长期以来的粗放型经济增长模式，严重破坏了水体环境及功能[1－2]。水体富营养化导致的“水华”号称水体“癌症”，长期困扰水环境工作者，其中铜绿微囊藻是形成“水华”的主要种类之一，由于其产生藻毒素，严重影响水体生态功能。传统物、化法控制水华，虽然高效迅速，但会破坏生态平衡并造成二次污染，因此寻求一种高效安全的抑藻方法具有重要意义。植物化感作用抑藻作为一种新型安全的生物抑藻技术备受青睐[3－4]。许多研究表明，水生、陆生植物以及某些大型藻类均具有抑制藻类生长的作用[5－8]。

仙人掌属植物(Opuntia SPP)栽培简单，无病虫害，在我国分布极为广泛。我国清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》记载仙人掌具有清热解毒、消肿止痛的药用价值;现在国内外许多学者研究发现仙人掌具有较强的抑菌消炎等多种药理作用。翁佩芳研究发现鲜仙人掌汁液抑菌作用明显，且对革兰氏阴性菌抑制作用强于阳性菌[9]。M.A.Alamsjah等人进一步证实抑菌物质可能是皂苷、生物碱、酚类、有机酸类等物质，仙人掌的抑菌机理可能是上述一种或几种物质水解了细菌细胞壁中的糖苷键，细胞壁结构被破坏出现部分缺失，形成缺壁细胞，细胞壁失去了对细胞内容物的保护作用，导致细胞质解体出现空腔;也可能是仙人掌提取物渗透入细胞内，吸附胞内带有阴离子的细胞质物质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌[10]。铜绿微囊藻属于原核生物其细胞壁结构与革兰氏阴性菌相似，而仙人掌又具有环境友好型、经济型抑藻剂潜在的开发价值，且仙人掌浸提液的抑藻实验研究，在国内未见报道。因此本文以铜绿微囊藻为研究对象，研究鲜仙人掌茎水浸提液及乙醇浸提液的抑藻效果，为开发高效、无毒、天然的除藻剂治理富营养化水体提供科学依据。同时植物水培技术的成熟与人工浮岛的广泛应用，为仙人掌属植物应用于富营养水体修复提供了可靠基础。

1 实验材料和方法

1.1 材料

实验藻种购自中国科学院水生生物研究所藻种库(FACHB-940)，是产毒藻株。仙人掌购自济南解放桥花卉市场。

1.2 铜绿微囊藻培养基成分

铜绿微囊藻培养基采用BG11培养基，其配方见表1。

表1 BG11培养基配方 mg/L

1.3 仙人掌浸提液的制备

鲜仙人掌茎水提取液:去刺、洗净、捣碎，与一定量的水混合，常温浸提3h，抽滤(重复3次)，合并滤液后于真空旋转蒸发仪上浓缩(水浴恒温58℃，水真空)，制成1g/mL的仙人掌水浸提液(即1mL浸提液含有鲜仙人掌的提取物1g)。

鲜仙人掌茎乙醇提取液:去刺、洗净、捣碎，按料液比1∶30(g/mL)加入72%(Ⅴ/Ⅴ)乙醇溶液，浸提3h，抽滤(重复3次)，合并滤液减压蒸馏，挥去乙醇，并在真空旋转蒸发仪上浓缩(水浴恒温58℃，水真空)，制成1g/mL的仙人掌乙醇浸提液。

以上两种提取方法得到的仙人掌浸提液又经过A、B两种处理。A处理:分别过细菌滤器除菌，并经紫外灭菌15min;B处理:高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

1.4 实验设计

将上述两种溶剂浸提的A、B两种处理的鲜仙人掌溶液分别加入装有100mL BG11培养基的250mL 锥形瓶，配成含有鲜仙人掌 0、20、40、60、80mg/mL的浓度梯度，每组3个平行。将对数生长期的藻液接种于上述浓度梯度的培养基中，于恒温培养箱中培养，光强2150lux，光暗比12h∶12h，光照期间温度为29±1℃，无光照期间温度为23±1℃，每天8:00，12:00，16:00，20:00 定时摇瓶2min，转速30rmp，共培养 7d。

1.5 细胞数及叶绿素a的测定和叶绿素a的抑制率计算

每24h用血球计数板在显微镜下(10×40倍)计数藻数。实验第7天测定了B处理组的不同浓度组叶绿素a的含量，取样体积为50mL，在抽气负压小于50kPa的条件下，经玻璃纤维滤膜过滤。过滤后的滤膜1h内放入15mL具塞试管中，加入10mL体积分数为90%的丙酮，盖紧试管塞，振荡后铝箔包裹立即放入冰箱，萃取20h。测定时取出样品30min，使样品温度与室温一致后，荧光分光光度法测定叶绿素a含量，按下式计算各组叶绿素a的抑制率，用来表征不同方式不同浓度的浸提液对藻类的抑制效应。

抑制率(%)=(对照组吸光光度变化值－样品的吸光光度变化值)/对照组吸光光度变化值 ×100%

2 结果与分析

2.1 不同浓度鲜仙人掌水浸提液胁迫下铜绿微囊藻细胞数量的变化

图1 鲜仙人掌水浸液对铜绿微囊藻生长的影响

从图1可以看出随着鲜仙人掌水浸提液浓度的升高，铜绿微囊藻细胞数量持续下降。只有20mg/mL组在实验前5天藻细胞数高于对照组，因为仙人掌茎含有蛋白质、维生素、有机酸、树脂、矿物质及丰富的黄酮类物质，可能是少量的仙人掌提取液刺激了铜绿微囊藻的生长。因为尽管铜绿微囊藻是光合自养菌，但曾有报道在微量有机碳源存在下其生长会更好[11]。除100mg/mL实验组外，各组均随着实验进行细胞持续增加。100mg/mL实验组第4天镜检就已经发现藻细胞已经严重退绿黄化，第5天藻已全部死亡降解，镜检不到完整细胞。

图1显示，A、B处理组对藻的抑制效果无明显差异，说明仙人掌有效抑藻成分比较稳定不会受高温破坏。

2.2 不同浓度鲜仙人掌乙醇浸提液胁迫下铜绿微囊藻细胞数量的变化

图2 鲜仙人掌乙醇提取液对铜绿微囊藻生长的影响

图2显示随着鲜仙人掌乙醇提取液浓度的增加，藻细胞数量持续下降。80mg/mL、100mg/mL实验组细胞数量随实验进行细胞持续下降，80mg/mL组实验结束时镜检未见到完整细胞，完全分解;100mg/mL实验组实验第3天细胞即全部死亡分解。说明鲜仙人掌乙醇提取液比水提取液中抑藻成分活性高。A、B处理组对藻的抑制效果无明显差异，乙醇提取液中抑藻成分未受高温、紫外破坏。

2.3 不同浓度鲜仙人掌浸提液胁迫下铜绿微囊藻叶绿素a含量的变化

图3、图4分别显示鲜仙人掌水、乙醇提取液对铜绿微囊藻叶绿素a含量及叶绿素a抑制率的影响，从图中可以看出鲜仙人掌乙醇提取液比水提取液活性高。

图3 鲜仙人掌水提取液及乙醇提取液B处理组对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

图4 鲜仙人掌水提取液及乙醇提取液B处理组对铜绿微囊藻叶绿素a抑制率比较

3 讨论

本实验结果显示鲜仙人掌水浸提液及乙醇浸提液均能有效抑制铜绿微囊藻的生长，且强度随浸提液浓度的增大而明显增强。鲜仙人掌的72%乙醇浸提液的抑藻效果大于水浸提液，可能是乙醇对仙人掌的有效抑藻成分提取更加完全的缘故，但具体是仙人掌汁液中哪种化学物质起到抑藻作用及是否是多种成分联合抑藻还需进一步研究。选用乙醇作为仙人掌的提取溶剂可提高抑藻剂的有效性，结合其抑藻效率及考虑抑藻成本在大剂量及预防水华爆发时使用可选择水浸提液。若仙人掌根中有效抑藻成分高且其为胞外分泌物则可选择浮床水培直接抑藻，不仅可以化感抑藻而且通过定期收割仙人掌还可除去水体氮磷等营养盐减轻水体富营养化。开发抑藻剂需要抑藻成分达到一定的浓度，除乙醇外其他有机溶剂是否对鲜仙人掌抑藻成分有更高的提取效率有待于进一步研究;筛选高效植株、品种及考察一年生及多年生植株的抑藻活力的差异也是必要的。

化感抑藻物质可以通过多种途径抑制藻类生长，前人研究仙人掌杀菌机理可能是通过破坏细胞壁结构，本实验研究发现两种提取液均抑制了铜绿微囊藻叶绿素a的含量，因此鲜仙人掌化感抑藻机理是上述哪种方式及是否是多种方式协同作用有待于进一步研究。

4 结论

(1)鲜仙人掌茎的水浸提液和乙醇浸提液对铜绿微囊藻均有明显的抑制作用，且有较好的量效关系，乙醇浸提液抑制效果强于水浸提液。

(2)鲜仙人掌茎浸提液抑藻成分稳定，经紫外高压蒸汽灭菌后仍具有较强抑藻效果。

(3)鲜仙人掌有应用于水体富营养化治理和开发新型抑藻剂的潜力。

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