邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪红细胞微核的影响

张维建，石兴玲，张超

(1.山东建筑大学 市政与环境工程学院，山东 济南 250101;2.山东建筑大学外语学院，山东 济南 250101)

0 引言

邻苯二甲酸二乙酯是生产聚氯乙烯的原料。伴随我国聚氯乙稀产业的发展，邻苯二甲酸二乙酯造成的水质污染日趋严重。该物质已成为水环境中检出最多的有机污染物之一[1]。有关邻苯二甲酸酯类(PAES)物质的遗传毒性研究，国内见有胡晓晴、陈如等的报道，国外见有M.Mariko，H.K.Mutsuko的报道[2－9]，但仅限于邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯等对鱼类、藻类的毒性研究 ，对蟾蜍蝌蚪红细胞微核的影响未见报道。本文探讨了邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪的致突变作用，以丰富毒理学资料。

1 邻苯二甲酸酯研究概述

邻苯二甲酸酯类物质(PAES)共有14种，包括邻苯二甲酸二甲酯、(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)等，属有机化合物，为无色油状粘稠液体。

地表水和地下水中的邻苯二甲酸酯主要来源于工业废水的排放、PVC塑料的缓慢释放和新的垃圾渗滤液[7]。邻苯二甲酸二乙酯(DEP)主要通过呼吸道、消化道和皮肤粘膜接触侵入人体[4]。邻苯二甲酸二乙酯已被美国环保署列入环境激素类物质[10]。

2 邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪红细胞微核影响的实验研究

2.1 材料

本实验所用邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)，为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。分子式:C12H14O4分子量:222.24。

实验所用中华蟾蜍蝌蚪采自山东建筑大学映雪湖，平均体重0.22g。试验前将其置2000mL烧杯，暴气蒸馏水饲养一周，水温18℃。每天上午投放一次磨细的饵料，按时观察蝌蚪的生理状态。

2.2 方法

(1)染毒实验组采用不同浓度邻苯二甲酸二乙酯染毒，染毒浓度:1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.5μg/mL、13μg/mL、26μg/mL。染毒时间为 24h。对照组采用蒸馏水处理。每组10只蝌蚪;实验前进行预实验。

(2)制片取蝌蚪用纱布将体表水分擦干，在前肢和身体连接处断肢，取血涂片晾干，瑞士染色，光学显微镜观察。每组制备10张涂片，每片观察2000个细胞，记录具有微核及核异常的细胞数，观察结果以千分率(‰)表示。实验数据采用Matlable7.0统计软件处理。

微核率=微核总数/观察细胞总数×1000‰。

核异常细胞率(ONA‰)=具有核异常(除微核外)的细胞总数/观察细胞的总数×1000‰

3 结果与讨论

3.1 结果

3.1.1 不同浓度邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪红细胞的影响

不同浓度邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪红细胞微核的影响见表1。

表1 不同浓度邻苯二甲酸二乙酯对蝌蚪红细胞微核的影响(n=10)

表1 不同浓度邻苯二甲酸二乙酯对蝌蚪红细胞微核的影响(n=10)

注:* 为 P ＜0.05;＊＊为 P ＜0.01。

邻苯二甲酸二乙酯浓度/(μg·mL－1)核异常细胞率/‰0.0(对照)微核率/‰0.2 ±0.05 0.1 ±0.041.6 0.3 ±0.15 0.2 ±0.143.2 0.4 ±0.05 0.4 ±0.046.5 1.2 ±0.04* 1.3 ±0.05*13. 1.4 ±0.11＊＊ 1.5 ±0.08＊＊26. 1.8 ±0.13＊＊ 1.9 ±0.08＊＊

3.1.2 邻苯二甲酸二乙酯与蟾蜍蝌蚪红细胞微核率及核异常率的相关分析

邻苯二甲酸二乙酯与微核率相关分析显示，r=0.9187，P ＜0.01，邻苯二甲酸二乙酯浓度与蝌蚪红细胞微核率高度相关。DEP浓度与蟾蜍蝌蚪红细胞核异常率的相关系数 r=0.9043，P ＜0.01，邻苯二甲酸的浓度与蟾蜍蝌蚪红细胞核异常率高度相关。

分别以蟾蜍蝌蚪红细胞微核率、核异常率为因变量(y)，以邻苯二甲酸二乙酯浓度为自变量(x)进行回归分析，得到回归方程，见表2。

表2 微核率及核异常率与邻苯二甲酸二乙酯染毒浓度的关系

不同浓度邻苯二甲酸二乙酯与蟾蜍蝌蚪红细胞微核的剂量—效应关系见图1。

3.2 讨论

3.2.1 邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪红细胞微核的影响

环境激素是指由于人类的生产和生活活动而释放到环境中的、对人体内和动物体内原本营造的正常激素功能施加影响，从而影响内分泌系统正常功能的化学物质，通称“外源性干扰内分泌的化学物质”[10]。在14种邻苯二甲酸酯类物质中，有6种被美国环保局(EPA)列为优先控制污染物，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)首列其中[5]。

由表1可见，邻苯二甲酸二乙酯浓度升高至6.5 μg/mL时P＜0.05、对蝌蚪红细胞产生显著毒性作用，当浓度升高至 13μg/mL和 26μg/mL时，P＜0.01，差异显著，表明此浓度邻苯二甲酸二乙酯对蝌蚪红细胞微核有明显影响。实验结果还显示，伴随邻苯二甲酸二乙酯浓度升高，蟾蜍蝌蚪红细胞出现小核，双核及核皱缩，核质外凸、核质内凹、核碎裂现象。

图1 邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪血红细胞微核的影响

由图1可见，伴随邻苯二甲酸二乙酯浓度的升高，蟾蜍蝌蚪红细胞微核细胞率，核异常细胞率不断升高。邻苯二甲酸二乙酯的浓度与微核率之间存在明显的剂量—效应关系。

3.2.2 建立回归方程的意义

本实验分别以邻苯二甲酸二乙酯浓度为自变量，以受试蟾蜍蝌蚪红细胞微核率为因变量，推导出回归方程。其意义是可根据水体中两栖类蝌蚪红细胞微核率数据，推测水体邻苯二甲酸二乙酯类物质的浓度，为开展邻苯二甲酸二乙酯水污染生物监测提供重要依据。

3.2.3 两栖类的使用

两栖类动物生活周期复杂，其幼体及成体均生活在水中。因皮肤湿润，渗透性强，易吸收水体中外源性激素，污染物能在其体内富集和放大，使细胞、组织及生理功能发生显著改变，影响其生长发育，因此在水体有害物质及水质的监测中被广泛用作指示生物。美国内分泌干扰物筛选与检测顾问委员会还建议将两栖类作为一种模型动物用于评价内分泌干扰物的繁殖和发育毒性。微核试验是检查环境污染物对细胞染色体损伤效应的一种简便快速有效的致突变性筛选方法。蝌蚪细胞分裂旺盛，研究表明用蝌蚪红细胞检测水体的环境污染物致突变时，其灵敏度要高于鱼类微核试验和细菌学试验(Ames试验)[4]。

3.2.4 邻苯二甲酸二乙酯毒作用机理的探讨

邻苯二甲酸二乙酯分子结构与雌激素分子结构类似，可与雌激素竞争受体，影响雌激素功能，或影响细胞信号转导途径，使胚胎体内雌激素水平改变，导致胚胎性分化过程异常。有实验证明在生物体内，邻苯二甲酸二乙酯主要代谢为邻苯二甲酸单酯。邻苯二甲酸单酯侧链越长，干扰作用越明显[4]。

4 结论

邻苯二甲酸二乙酯可引起蟾蜍蝌蚪红细胞微核率升高。在其浓度升高至13μg/mL、26μg/mL时，红细胞微核率明显升高，与对照组相比差异显著P＜0.01。同时还出现小核，双核及核皱缩，核质外凸、核质内凹、核碎裂现象。邻苯二甲酸二乙酯的浓度与微核率之间程高度相关，存在剂量—效应关系。邻苯二甲酸二乙酯对蟾蜍蝌蚪有明显的至突变作用，可导致蟾蜍蝌蚪红细胞染色体的损伤。

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