安阳固本膏中血竭素的HPLC含量测定

李长达

安阳固本膏具有温肾暖宫，活血通络的功效，主要用于女子宫寒不孕，经前腹痛，月经不调;男子精液稀薄，精子少，腰膝冷痛等的治疗。安阳固本膏是由肉桂、附子、艾叶、血竭等23味中药经提取分离后制成的中药复方制剂，而血竭［1］为传统名贵中药，具有活血定痛，化瘀止血，生肌敛疮的功效，血竭中含有黄酮类、苷类、酚类、有机酸等多种化学成分，其中血竭素是其主要药效成分之一。现以血竭素的含量为指标，采用HPLC法对方中血竭进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 1525系列高效液相色谱仪(1525 HPLC泵，2487双波长紫外检测器);BP211D电子天平。

1.2 试药 血竭素高氯酸盐对照品(中国药品生物制品检定所提供);3批安阳固本膏样品(市售);乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 血竭素的含量测定

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(45∶55);流速:1.0 ml/min;检测波长:440nm;进样量:10.0 μl;柱温:30℃。在上述色谱条件下，分别取“2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液进样，结果对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液无吸收峰。见下图。

图1 HPLC图

2.2 溶液配制 对照品溶液的制备:精密称取血竭素高氯酸盐对照品，加3%磷酸甲醇溶液制成每1 ml含血竭素10 μg(血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量/1.377)的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备:取剪碎的本品15 g，加硅藻土2 g，加入3%磷酸甲醇溶液50 ml，加热回流30 min，冷却，滤过(0.45μm微孔滤膜)，取续滤液，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备:取按处方及工艺制备的不含血竭药材的样品，按供试品溶液的制备同法制备阴性对照溶液。

2.3 线性试验 精密称取血竭素对照品适量，加3%磷酸甲醇溶液溶解并分别制成每 1 ml含 4.357 μg、6.536 μg、8.715 μg、13.072 μg、26.144 μg 的对照品溶液，分别进样测定。以浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程:Y=3113380X-17807(r=0.9998)，表明血竭素在0.04357～0.26144 μg范围内线性关系良好。

2.4 精密度、重现性和稳定性试验 精密度试验:取血竭素对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样测定5次，得峰面积值的RSD为0.8%。

重现性试验:取同一批样品，共6份，照“2.2”项下方法制备供试溶液，按上述色谱条件，分别进样测定，测得含量的RSD为0.6%。

稳定性试验:取同一供试品溶液，按上述色谱条件，于配制后第 0、1、2、3、4 h分别进样测定，得峰面积值的 RSD为0.9%。

2.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批号安阳固本膏样品(含量为0.035 mg/g)6份，研细，取适量，精密称定，分别精密加入定量的血竭素对照品溶液(浓度为0.0255 mg/ml)。按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，分别进样测定，计算加样回收率。得加样回收率为97.8%，RSD=0.4%(n=6)。

表1 加样回收率试验结果表

2.6 样品测定 取3批安阳固本膏样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定血竭素含量。结果3批安阳固本膏样品每张含血竭素的平均含量分别为0.81 mg、0.74 mg、0.85 mg。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 实验分别比较了用甲醇、三氯甲烷-甲醇(1∶1)、三氯甲烷、3%磷酸甲醇溶液［2］等为提取溶剂，结果以3%磷酸甲醇溶液提取率最高，故最后确定采用3%磷酸甲醇溶液为提取溶剂。

3.2 提取方法的选择 实验分别采用超声处理30 min、1 h，加热回流30 min、1 h进行提取［3］，结果以加热回流30 min提取效果最佳，故最后确定采用加热回流30 min进行提取。

［1］国家药典委员会.中国药典.一部.北京:中国医药科技出版社，2010:133.

［2］苏健，王宝琴，韩敏彩，等.进口与国产血竭含量测定方法研究进展.中国中医药信息杂志，2005，12(1):49-50.

［3］邱碧菡，陈军霞，卞凌，等.血竭中血竭素的提取方法比较.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):22-24.