诱导血红素加氧酶-1对肝硬化大鼠肠黏膜屏障的保护作用

王珅 方志强

肝硬化(hepatic cirrhosis，HC)发展过程中常伴随肠黏膜屏障的损伤［1］，肠道内大量细菌向肠腔外移位，可引起全身炎性反应综合征和多器官功能衰竭［2］。因此，重建肠道屏障的完整性在肝硬化治疗中显得尤为重要。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是血红素代谢中的限速酶，炎症等刺激可诱导其表达，具有细胞保护作用［3］。本实验通过建立四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)致大鼠肝硬化动物模型，观察HO-1诱导对肠黏膜屏障的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 FITC-葡聚糖、钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)(Sigma公司);小鼠抗大鼠Bcl-2一抗及山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司);小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司);ELISA试剂盒(BioSource公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒、脂质氧化(MDA)检测试剂盒及TUNEL试剂盒(碧云天公司)。

1.2 肝硬化动物模型的建立 建立肝硬化动物模型的方法参照文献［4］，简述如下:选取健康雄性 Wistar大鼠40只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重210～240 g，随机分为2组:control组(n=8):以正常饮食喂养;HC组(n=32):建模第一天，大鼠背部皮下注射CCl4原液(5 ml/kg)。以后每隔3日，皮下注射40%的CCl4橄榄油溶液(3 ml/kg)。饲料前两周为79.5%玉米面、20%猪油及0.5%胆固醇，从第三周起为99.5%玉米面与0.5%胆固醇，10～30%饮用酒为其唯一饮用水。六周末可形成HC。建模中HC组病死率为34.4%(11/32)，对照组无死亡。

1.3 诱导HO-1表达 在HC组中随机选取10只大鼠诱导HO-1表达，为HC+HO组。实验方法参照文献［5］，简述如下:HC+HO组大鼠每周两次皮下注射CoPP(1.5 mg/kg)，共两周。作为对照，control组与HC组均注射NaOH溶液(0.1 mol/L，pH 8.3)。

1.4 肠黏膜通透性检测 将大鼠麻醉后开腹手术，仔细分离出距回盲瓣5 cm处的下段回肠10 cm，两端以棉线扎紧。将浓度为2 g/L的FITC-葡聚糖注入该肠段至充盈。30 min后取门静脉血1 mL、分离血浆。多功能酶标仪检测血浆中的荧光强度(激发光488 nm，发射光525 nm)。如测定值超过检测上限，可同比例稀释样本。以各组测定值与control组的平均荧光强度之比作为反映肠黏膜通透性的相对指标。

1.5 血浆及肠组织匀浆生化指标的检测 经腹主动脉取血，分离、分装血浆并冻存于-80℃待检。同时取一段回肠组织制备组织匀浆，4℃ 12500 g超速离心10 min后收集上清液。检测上清液中回肠组织蛋白浓度(BCA法)。ELISA法检测血浆肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor α，TNF-α)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。脂质氧化检测试剂盒检测肠组织匀浆丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.6 回肠组织HO活性的测定 以胆红素生成量反映大鼠回肠组织HO的活性，方法参照文献［6］，并略作修改。将一定蛋白含量的回肠组织匀浆上清液加入体积为1.2 mL的反应体系，其中包含:大鼠肝细胞溶质(2 mg)、NADP(0.8 mmol/L)、6-磷酸葡萄糖(1 mmol/L)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(0.2单位)。最后添加20 μL氯高铁血红素(2.5 mmol/L)作为酶反应底物。37℃水浴避光反应20 min，置于冰上终止反应。用多功能酶标仪在于464 nm和530 nm处测定吸光度。胆红素浓度c=(A464-A530)/εb。式中ε=40(mmol L-1)-1 cm-1，为胆红素的吸光系数;b为光程长度(cm)。HO活性表示为每mg组织蛋白在1 h内催化生成的胆红素的量。

1.7 肠黏膜凋亡细胞原位缺口末端标记法(TUNEL)检测 10%甲醛固定回肠末端组织(应避开做通透性检测的肠段)，石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，蛋白酶K(20 mg/L)37℃孵育30 min。PBS冲洗2 min ×3次，3%H2O2甲醇室温封闭30 min。PBS洗片后加入TUNEL反应液50 μL/张切片，37℃避光孵育1 h。PBS洗片2 min ×3次，加入 POD 50 μL，37℃孵育30 min。PBS洗片2 min×3 次，DAB显色10 min，光学显微镜观察并拍照。实验重复3次。

1.8 Western blot 将含20 μg蛋白的回肠组织匀浆上清液上样于15%的SDS-PAGE，电泳分离，之后将蛋白转移至PVDF膜上。用小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体检测。以β-actin为内参。实验结果以同一样本Bcl-2蛋白与β-actin蛋白表达量的比值表示。实验重复3次。

2 实验结果

2.1 肠组织HO活性的变化 为确定HC大鼠HO-1的诱导情况，我们检测了各组大鼠肠组织HO的活性。结果显示，与control组相比，HC组大鼠肠组织HO活性即显著升高(P＜0.01);经CoPP诱导后，HC+HO组大鼠肠组织HO活性显著高于HC组(P＜0.01，图1)。

图1 各组大鼠肠组织HO活性的变化

2.2 诱导HO-1对肝硬化大鼠肠黏膜通透性的影响 如图2所示，与control组比较，HC组大鼠肠道通透性显著增高(P＜0.01)，相对荧光强度达到前者的3倍左右。经HO-1诱导后，HC+HO组大鼠肠道通透性比HC组显著降低(P＜0.05)。

图2 诱导HO-1对肝硬化大鼠肠道通透性的影响

2.3 各组血浆TNF-α及IL-6与肠组织匀浆MDA含量的变化 血浆 TNF-α水平在 HC组显著高于control组(P＜0.01)，而在HC+HO组显著低于HC组(P＜0.05);IL-6水平在HC组显著高于control组(P＜0.01)，但在HC与HC+HO两组间未见显著性差异。肠组织匀浆MDA含量在HC组显著高于control组(P＜0.01)，而在HC+HO组显著低于HC组(P＜0.01)，见表1。

表1 各组血浆TNF-α及IL-6与肠组织匀浆MDA的含量

2.4 诱导HO-1对肝硬化大鼠肠黏膜细胞凋亡的影响Control组大鼠肠黏膜上皮凋亡细胞数量很少(图3A)，而HC组可见大量肠黏膜上皮细胞凋亡，固有层和腺上皮细胞亦可见凋亡，阳性细胞呈棕黄色(图3B)。诱导大鼠表达HO-1后，肠黏膜凋亡细胞数明显减少(图3C)。

图3 诱导HO-1减轻肝硬化大鼠肠上皮细胞凋亡

2.5 诱导HO-1对肝硬化大鼠肠组织Bcl-2表达的影响HC组大鼠Bcl-2蛋白表达量为0.05±0.02，显著低于control组的0.22±0.17(P＜0.01)。而诱导HO-1可使肝硬化大鼠回肠Bcl-2蛋白表达量升高至0.58±0.24(P＜0.01)，已显著高于control组(P＜0.01)(图4)。

图4 诱导HO-1上调肝硬化大鼠肠组织Bcl-2表达

3 讨论

肝纤维化肝硬化时肠黏膜通透性增加可导致细菌向肠外移位、内毒素血症形成及自发性腹膜炎的产生［7］。肠源性内毒素血症的形成可激活Kupffer细胞合成与释放炎性介质如TNF-α等进一步损伤肠屏障功能［8］。内毒素血症还对肝脏造成“二次打击”［9］，诱发炎性介质大量释放，继而反复、持续地损伤肝细胞。因此，在肝硬化治疗中应以重建肠屏障完整性、防止内毒素血症形成为重要策略。

HO系统具有显著的抗炎、抗氧化等细胞保护作用［10］。HO是血红素代谢的关键酶，催化其降解产生胆红素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和铁。在哺乳动物中存在两种HO同工酶［5］，即 HO-1和 HO-2。HO-1可在氧化应激、辐射、炎症及低氧等刺激下被诱导表达［11］。本研究以CoPP皮下注射诱导大鼠表达HO-1。有资料表明CoPP不会影响HO-2的表达量［5］，故本研究检测肠组织HO活性即可显示HO-1表达量的变化。

我们的研究结果显示，与对照组相比，肝硬化大鼠肠黏膜通透性显著增高;诱导大鼠表达HO-1可显著降低肝硬化大鼠肠黏膜的通透性。为探讨HO-1对大鼠肠屏障的保护机制，我们首先考虑其抗炎作用是否参与其中。通过对血浆炎症因子TNF-α及IL-6的检测，发现在肝硬化大鼠中这两种细胞因子血浆含量均显著高于对照组，说明在纤维化形成过程中炎症介质的释放可能参与了对肝、肠的损伤。诱导HO-1表达可显著降低肝硬化大鼠血浆TNF-α水平。同时结合对肠组织匀浆MDA的检测，发现HO-1诱导可降低肝硬化大鼠肠MDA水平。说明HO-1可使大鼠体内脂质过氧化程度降低，间接反映出其对肠组织损伤的保护作用。

细胞凋亡常常也是导致上皮组织紧密连接破坏、通透性增高的重要原因［12］。本研究发现肝硬化大鼠肠黏膜凋亡细胞数量显著高于对照组，说明细胞凋亡可能参与了肝硬化大鼠肠黏膜通透性的升高。诱导HO-1表达可降低肝硬化大鼠肠黏膜细胞凋亡。我们还考察了抗凋亡蛋白Bcl-2在各组中的表达情况。肝硬化大鼠肠组织Bcl-2表达低于对照组，但其在HO-1诱导之后表达水平明显增加，这可能是肠黏膜细胞凋亡减少的关键信号。

最近在对小鼠肝脏缺血/再灌注模型的研究中发现［13］，诱导HO-1表达可增加信号蛋白STAT3的磷酸化，后者激活PI3K/Akt通路、降低缺血再灌注诱导的细胞凋亡。诱导HO-1保护肝硬化大鼠肠黏膜屏障的分子机制值得在今后的研究中进一步探讨。

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