nHA／PCL复合材料组分配比对成骨细胞骨相关基因表达的影响研究

唐俊龙，王朝元，刘 介

（中南民族大学 生命科学学院，湖北 武汉 430074）

1 引言

骨包括有机相（非胶原蛋白和胶原）和无机相，羟基磷灰石（HA）是骨无机相的主要成分，约占干骨组织的45%。用HA来做骨植入材料不仅生物相容性高、机械性能好、化学性能稳定，还能明显的促进骨的生长，故长期以来作为生物活性材料。但纯HA因脆性大、抗疲劳性强度不高、难以降解［1］等缺点限制了临床应用。聚已内酯（PCL）是线性的脂肪聚酯，具有良好的生物降解性和相容性［2］，但其强度低难以满足骨植入材料的要求。因此，我们制成纳米羟基磷灰石／聚已内酯（nHA／PCL）复合材料，它结合了两种材料的优点，具有良好的生物相容性并能促进成骨细胞的增殖［3］，有望成为一种具有临床前景的新颖骨替换材料。李家峰，万美蓉［4］等的研究显示人骨髓间质干细胞经nHA／PCL过纳米羟基磷灰石／聚已内酯复合物诱导后其骨相关基因mRNA的表达上调。说明HA的加入可以提高惰性材料的生物活性，nHA／PCL可以预期，纳米羟基磷灰石／聚已内酯复合物具有良好的体内成骨作用。

本文集中探讨不同配比纳米羟基磷灰石／聚已内酯（nHA∶PCL＝0∶100、nHA∶PCL1＝40∶60、nHA∶PCL2＝60∶40）对成骨细胞骨相关基因表达的影响，能从分子水平了解HA在复合材料中的作用和影响成骨细胞的分子机理，为其临床应用提供理论依据。

2 实验部分

2.1 试剂和仪器

nHA／PCL复合材料（华东理工大学生物材料研究所），小鼠成骨细胞株（MC3T3－E1，上海细胞生物研究所），DMEM培养基（Hyclone），新生牛血清（杭州四季清）、青霉素（BIOSHARP）、链霉素（BIOSHARP），反转录试剂盒（Fermentas），胰蛋白酶（Amresco），二甲基亚砜（Amresco），ALP试剂盒（南京建成生物科技公司），Trizol（Invitrogen），PCR 引物（武汉 博越 技术 有限 公司），反转录试剂盒（Fermentas）。CO2培养箱（HF90／240型，利康生物医疗科技控股集团），倒置显微镜（Motic AE21型，重庆光学仪器），普通PCR仪（Biometra，德国），凝胶成像分析仪 （JS－380A，上海培清科技）。

2.2 原代小鼠颅骨成骨细胞（PMO）培养

将新生昆明种小鼠头颅剪碎，0.25%胰酶消化后，加入5mL培养基（含10%新生牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL链霉素），1500r／min离心5min沉淀细胞，弃上清，加培养基，转入培养瓶中于37℃、5%CO2饱和度条件下培养。

2.3 nHA／PCL复合材料的制备

nHA和PCL按0∶100；40∶60；60∶40不同比例混匀，PCL在15MPa压力下3min形成片状。用砂纸打磨材料片表面并漂洗干净，湿热灭菌后备用。

2.4 不同配比nHA／PCL复合物对骨相关基因表达

将细胞以2×105个／cm2浓度接种于培养皿中的nHA／PCL片上，并以同样浓度的细胞接种于普通玻璃培养瓶中作为空白对照。静置2h，让细胞贴壁。每皿加入含10%新生牛血清的DMEM培养基将材料片浸没，置培养皿于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，每3～4d换1次培养基，收集培养2、6、12d的细胞。Trizol法提取总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转成为cDNA，以cDNA为模板，用骨相关基因引物（表1）进行普通PCR。PCR反应条件：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，68℃，90s，30个循环；68℃，5min。以 GAPDH 为内参基因，通过2%琼脂糖凝胶电泳来确定骨相关基因的表达差异。用SensiAnsys软件对目标基因与GAPDH灰度比来计算表达量。

表1 骨相关基因PCR扩增的引物序列

3 结果与分析

3.1 不同材料对骨相关基因表达的影响

3.1.1 不同材料对成骨细胞OP基因表达的影响

不同材料片对成骨细胞OP基因mRNA表达的影响见图1。由图1可见，经2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO细胞的上生长的成骨细胞的OP基因表达量高于对照和PCL材料片上的OP基因表达量或者接近，而PCL材料片上生长的细胞OP基因表达量要低于对照组（图1a）。在 MC3T3－E1细胞的OP基因系中也有相同趋势（图1b）。

图1 nHA／PCL and PCL对PMO和MC3T3－E1细胞OP表达的影响

3.1.2 不同材料对成骨细胞ON基因表达的影响

不同材料片对成骨细胞ON基因表达的影响见图2。由图2可见，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO细胞ON基因表达量均高于对照和PCL材料片上的ON基因表达量，而PCL材料片上生长的细胞ON基因表达量要低于对照组（图2a）。在MC3T3－E1细胞的ON基因系中也有相同也出现了相似的趋势（图2b）。

图2 nHA／PCL and PCL对PMO和MC3T3－E1细胞ON表达的影响

3.1.3 不同材料对成骨细胞OC基因表达的影响

不同材料片对成骨细胞OC基因表达的影响见图3。经2、6、12d，OC基因的表达变化不大。2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生长的成骨细胞的OC基因表达量高于对照和PCL材料片上的成骨细胞OC基因表达量。PCL材料片上生长的细胞OC基因表达量要低于或近似于对照组。

图3 nHA／PCL and PCL对PMO和MC3T3－E1细胞OC表达的影响

3.1.4 不同材料对成骨细胞ALP基因表达的影响

不同材料对成骨细胞ALP基因表达的影响见图4。由图4可见，经2、6、12d，ALP基因的表达量逐步降低。12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生长的细胞的ALP基因表达量比对照的ALP基因表达量要低于或近似于对照组。

图4 nHA／PCL and PCL对PMO和MC3T3－E1细胞ALP基因表达的影响

4 结语

本文以成骨细胞样细胞系（MC3T3－E1）和原代小鼠成骨细胞（PMO）这两种成骨细胞作为材料研究的模式细胞，前者具有成骨细胞的基本生物学特性，包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ－型胶原合成和基质矿化等；后者则更接近体内细胞活性，以此对比相同材料对不同成骨细胞的影响差异。

成骨细胞在骨形成过程中经历分裂增殖、分化成熟和基质钙化3个阶段［5］。其中碱性磷酸酶（ALP）是一种膜结合蛋白，可水解有机磷酸酯为基质提供足够的磷酸浓度使钙盐沉积于基质上，它在分化早期大量表达，在骨基质成熟过程中起重要作用，是成骨细胞分化的早期标志。骨钙素（OC）是由成骨细胞合成和分泌的一种非胶原蛋白，它是构成成骨细胞胞外基质成分之一，能维持矿化速度，抑制异常羟基磷灰石的形成。骨连蛋白（ON）能促进细胞外基质蛋白之间的相互作用。骨桥蛋白（OPN）广泛分布于多种组织和细胞，是一种非胶原骨基质糖蛋白，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，同时调节细胞的粘附、迁移、增殖、分化等过程。这些蛋白在成骨细胞分化成熟和基质钙化过程中均有重要作用，其对应的基因统称为骨相关基因。

实验结果表明：nHA／PCL1、nHA／PCL2在一定程度上促进了OC、ON、OPN的表达，而对ALP的表达有较低的抑制作用，在MC3T3－E1和PMO细胞上表现无差别。说明nHA／PCL复合材料具有良好的细胞相容性和促成骨细胞活性，在惰性材料中加入一定比例的HA等材料，可提高材料的生物活性，与前人研究结果［5］一致。以此材料为基础，可进一步优化设计，开发出新型的具有临床应用前景的骨修复材料。

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