鸡马立克氏病的诊断

2012-08-25王雪松李常国

中国畜牧兽医文摘 2012年1期

王雪松李常国

（辽宁省食品药品检验所，沈阳 110023）

马立克氏病（MD）是最常见的一种鸡淋巴组织增生性传染病。它是由马立克氏病毒（MDV）引起鸡的一种高度接触性传染性肿瘤疾病，以淋巴组织的增生和肿瘤形成为特征。马立克氏病是危害世界养禽业最严重的病毒性肿瘤性传染病。MD经羽毛囊排毒，空气传播，传染力极强，是鸡的3大主要疫病之一。该病于1907年由匈牙利病理学家Joseph Marek首先报道，1961年在英国科学家Biggs的倡导下，开始使用马立克病这一名称。MD存在于世界所有养禽的国家和地区，其危害随着养鸡业的集约化而增大，此病一旦发生，即可引起鸡大批死亡，给养鸡业造成严重的经济损失。MD是一种高度接触性疾病，通过直接或间接接触传播，也可通过空气传播。

在实习期间，我们确诊4例MD。病鸡大多表现为精神不振，食欲减退，羽毛松散，缩头耷翅，鸡冠和肉髯苍白萎缩，贫血，排水样稀便及黄白色或黄绿色下痢。病鸡消瘦迅速，体重减轻，昏迷，最后衰竭死亡。通过剖检变化，病理组织学观察以及琼脂扩散试验，在与其他症状相似的疾病相鉴别后，最后确诊为鸡马立克氏病。

MD主要侵害外周神经系统，以周围神经、性腺、虹膜、内脏器官、肌肉和皮肤的单独或多发的单核细胞浸润为特征[1]。该病具有高度传染性，也是一种免疫抑制性疾病[2]。

MDV在细胞培养条件下呈一种严格细胞结合状态，MD的病原是在1967年由Churchill和Biggs．通过体外增殖和后来从MD肿瘤细胞分离获得疱疹病毒才得以确定的。目前，将MDV毒株分为3个血清型。其中，引起肿瘤的MDV毒株被归为l型，天然不致瘤的MDV为2型，而HVT毒株为3型[3]。

目前，采用免疫鸡群攻毒保护试验来判定MDV毒力的强弱，将血清l型MDV分为四种病原型，即温和型（mMDV）、强毒型（vMDV）、超强毒型（vvMDV）、特超强毒型（vv+MDV），其中每种致病型都有特定的临床症状[4]。

MD是目前已知的唯一可用疫苗成功预防的病毒性肿瘤病，因而在比较医学上，它是研究病毒性肿瘤的发生和预防机制的理想的动物模型。MDV是一群细胞结合型的疱疹病毒科的成员，在感染细胞内可见85～l00 nm的无囊膜病毒粒子，称为核衣壳。MDV的基因组成双股线形DNA，长度约为180 kb，裸露的病毒DNA对单层细胞和易感鸡都有感染性。MD的发生和严重程度，取决于病原、宿主和环境，这3者密切相关[5]。

本病无特效药物治疗，只能依靠免疫预防。也许只有时间才能告诉我们目前家禽业所采取的措施能否会给发生突变的MDV得以逃逸及增强其毒力的机会[7]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病料抚顺地区某农户送检的病死鸡5只。

1.1.2 试剂 MD阳性血清、MD沉淀抗原、甲醛、酒精（95%）、二甲苯、石蜡、甘油、苏木素、钾明矾、钾明矾、曙红、NACL。

1.1.3 实验仪器显微镜、电热恒温培养箱、切片机、水浴锅、座式自动电热压力蒸汽灭菌器、微量移液器、电炉、平皿、架盘药物天平、砝码、药匙、量筒、烧杯、玻璃棒、纱布、漏斗、毛刷、剪子、手术刀、镊子、载玻片、盖玻片、木块、废液缸、酒精灯、滤纸、树胶、新鲜蛋白等。

1.1.4 琼脂扩散试验平板制作首先称取1g琼脂粉，加至100mL8.5% 的高渗盐水中，煮沸使之溶解（在电炉子上加热，边加热边搅拌，直到溶液由浑浊变澄清为止）。然后待溶解的琼脂温度降至55℃左右时，将其倒入灭菌清洁的平皿中，厚度约2 mm。在琼脂凝固后，用打孔器在琼脂凝胶上打梅花孔。一般的打孔器有 7个孔，中心孔孔径为3 mm，周边孔孔径为3ml，孔距为3 ml。孔内的琼脂如未吸出，则用注射器针头挑出。最后将平皿在酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜）使琼脂与平皿贴紧。

1.1.5 试剂配制

固定液配制：福尔马林液

福尔马林（37%-40%甲醛）：100 ml 常水：500 ml苏木素染液：

第1液配方：苏木素1 g、无水酒精10 ml。第2液配方：钾明矾 20 g、蒸馏水200 ml。

第1液和第2液分别配制，第2液经过过滤后加入第1液中，盛染液的瓶口盖上纱布，置应用于日光下照射约2周，经过过滤后可以使用。

伊红水溶液的配制：伊红（水溶性）1 g、蒸馏水100 ml，混合后溶解即可应用，密封保存。

1%盐酸酒精液的配制：70%的酒精100 ml、浓盐酸1 ml。

1.2 实验方法

1.2.1 病理剖检

将送检的病例进行尸体剖检，外部检查之后用清水将禽体羽毛浸湿，切开大腿与腹侧连接的皮肤，用力将两大腿向外翻压直到两髋关节脱臼，使禽体背卧位平躺。在泄殖孔前的皮肤作一条横切线，由此切线中部沿腹中线由后向前剪开皮肤，直到喙角，使腹部和胸部皮肤分离，进行临床剖检诊断。

在对临床症状、尸体剖检的基础上，从待检鸡的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓丰富的羽毛供实验室检验，以寻求确诊。

1.2.2 琼脂扩散试验

采集羽髓：从被检鸡的羽毛丰厚处拔下羽毛，从羽根尖端剪下1 cm左右的一段，注意要露出羽髓。

加样：取琼脂平板1个，将琼脂平板6个孔编号，分别取5根露出羽髓的羽根，直接将其插入外周1、2、3、4、5孔中，外周的第6孔中用微量移液器加入MD标准抗原，向中心孔中加入标准阳性血清。然后将加样完毕的琼脂板加盖平放于带盖的湿盒内，置37℃温箱中，24 h内观察结果。

结果判定：被检材料与中心阳性血清空之间形成清晰的沉淀线则判为阳性，否则即为阴性。

1.2.3 病理组织学观察

取材固定；脱水透明；浸蜡包埋；切片贴片；修整展片；H·E染色。

2 结果与分析

2.1 病理解剖学变化

组织器官：皮肤表面出现多个、大小不等的、灰白色的肿瘤结节；心脏：表面有大小的灰白色结节，稍突出于心脏表面；肝脏：明显肿大，表面有白色小结节；脾脏：弥散性肿大；肾脏：弥漫性肿大并呈灰白色；腺胃壁：增厚。可参考图1所示变化。

图1 肝脏明显肿大，表面有白色肿瘤结节

2.2 琼脂扩散试验

羽髓琼脂扩散试验结果详见图2。

从图2可以看出，外周2、3、4、5、6孔的羽髓与中央的阳性血清之间均形成清晰的灰白色沉淀线，证明2、3、4、5这4根羽髓的AGP试验为阳性，1孔未形成沉淀线，为AGP试验阴性，而6孔为标准阳性抗原对照，检测结果也为阳性。

图2 琼脂扩散试验结果

2.3 病理组织学观察

2.2.1 心脏心肌纤维颗粒变性、水泡变性。在血管周围、肌纤维间、心外膜下有淋巴细胞呈浸润性增生。肌纤维脂肪变性，局部蜡样坏死。

2.2.2 脾脏鞘动脉周围、淋巴小结出现大量淋巴细胞、网状细胞。淋巴细胞核碎裂、边集，并见核分裂相。

2.2.3 肝脏肝细胞颗粒变性、水泡变性、部分坏死。窦周隙狭窄，散在少量的红细胞和淋巴细胞，狄氏隙扩张。中、小淋巴细胞、网状细胞在静脉周围浸润。在肝小叶内局灶性增生。增生灶内有呈空泡状的原始网状细胞和核边集的凋亡淋巴细胞。肝细胞坏死处有淋巴细胞集聚（详见图3）。

2.2.4 肾脏肾小球体积增大。肾小囊腔狭窄。并有血红蛋白样物质。肾小囊壁上皮细胞肿胀。局部肾小球萎缩，出现代偿性增大。肾小管上皮细胞从颗粒变性、水泡变性到细胞坏死、胞膜破裂，整个肾小管呈均质红染。肾小管内有血红蛋白样物质，呈尿管型（详见图4）。

2.2.5 坐骨神经神经纤维间水肿液内散在中小淋巴细胞及浆细胞。局部灶性增生。

2.2.6 卵巢皮质和髓质见有结节性或弥漫性网状细胞、淋巴细胞集聚。淋巴细胞核显分裂相，局灶性增生细胞排列呈涡漩状。部分卵泡全部被多形态淋巴细胞所代替。

2.2.7 腺胃腺小管腺细胞开始呈颗粒变性、水泡变性，逐渐坏死，腺小管内散在流失的胞浆。淋巴细胞和网状细胞在腺小管间、肌层间、浆膜下浸润和增生。

2.2.8 十二指肠肌层肌细胞和肠绒毛上皮细胞变性、坏死。浆膜、浆膜下、肌层、肠腺间和绒毛固有层出现不同程度的大中小淋巴细胞浸润和增生。肠腺间有网状细胞增生。

2.2.9 肺血管内、外散在淋巴细胞。血管周围肺小叶间隔有少量的淋巴细胞浸润，局部肺泡间隔及支气管周围充满大量的大中小淋巴细胞、少量的网状细胞。肺小叶内充满淋巴细胞、红细胞，局部实质内全被肿瘤细胞代替。

图3 肝细胞管内有多形态的淋巴细胞浸润

图4 肾小管之间见数量不等淋巴细胞浸润

3 结论与讨论

3.1 羽囊琼脂扩散试验

3.1.1 试验原理羽囊琼脂扩散试验是沉淀反应试验的一种，以琼脂凝胶作为载体，在1%以下的琼脂凝胶中可形成大于85 nm的微孔，可溶性抗原或抗体能在其中自由扩散，并由近及远形成浓度梯度。抗原和抗体在比例适当处相遇，形成颗粒较大的抗原-抗体复合物而不再扩散，出现肉眼可见的白色沉淀线。一种抗原抗体系统只出现一条沉淀线，复合抗原中的多种抗原抗体系统均可以根据自己的浓度、扩散系数、最适比等因素，形成自己的沉淀线。

3.1.2 试验特点羽囊琼脂扩散试验不需要精密的仪器且操作简单，技术上易掌握，在我国目前条件下比荧光抗体技术和免疫电泳等易于在基层兽医站或检验室推广应用。羽囊琼脂扩散试验所形成的沉淀线不但易于摄影记录，并可经染色后做永久标本。在与补体结合试验的比较中，羽囊琼脂扩散试验的阳性检出率要高于补体结合试验；应用本试验可以在同一个平皿中同时检测多种抗原或抗体，并可就反应后形成沉淀线的多少来辨识抗原是否纯净，因此适用于分析多种抗原成分的材料。应用琼脂扩散试验的缺点是试验过程中容易出现假阳性。

3.1.3 注意事项应多拔几根新羽来检查；加样时，以把孔加满为度，切忌样品溢出，影响判定结果；与邻接孔连片时应作废处理；MD阳性血清避免反复冻融，以防降低效价而影响检出结果；在琼脂扩散试验时，还要注意羽囊同时缘孔紧密吻合，防止羽囊径小，边缘孔大，否则抗原扩散不充分，降低查检率。

3.2 病理组织学观察

3.2.1 组织固定用于组织固定的材料必须新鲜，采集和分割后要立刻固定，不得延误；固定材料体积的大小，以不超过直径5 mm为准，材料与固定液的比例，以1∶20为准；所用固定液以新配的为好，并放置在阴凉处，不要在日光下直晒；材料固定完毕后，必须在容器外贴上标签，以防止相互混淆。

3.2.2 组织脱水组织脱水是在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体；在高浓度酒精中，每级停留时间也不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；脱水应彻底干净，否则与二甲苯混合后，将呈乳白色浑浊，虽然可以倒回重脱，但效果不好；如需过夜，应停留在70%酒精中。

3.2.3 组织块透明组织块透明时要注意二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否则待二甲苯挥发干净后，组织就会变硬发白，即使再加树胶封藏，由于树胶不能浸入组织，封后也无用处；二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入，出现白色云雾状；二甲苯必须保持无水无酸。若用1～2滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含有水分，不能再用。

3.2.4 石蜡切片制作检验过程中，石蜡切片制作出现了材料裂隙、破碎的情况，请做类似试验时借鉴。