枯草芽孢杆菌产果胶裂解酶培养基优化研究

杨秀松，张新平

（1. 国家食品药品监督管理局高级研修学院，北京 100073；2. 上海交通大学农业与生物学院，上海 201101）

枯草芽孢杆菌产果胶裂解酶培养基优化研究

杨秀松1，张新平2

（1. 国家食品药品监督管理局高级研修学院，北京 100073；2. 上海交通大学农业与生物学院，上海 201101）

通过 Plackett-Burman试验设计，从葡萄糖、果糖、豆粕粉、氯化铵、乙酸铵、硫酸铵、蛋白胨、酵母提取物、K2PHO4、KH2PO4、CaCl2等11个相关因子中筛选出对枯草芽孢杆菌产果胶裂解具有显著影响的因子——果糖、豆粕和酵母提取物，选取因子豆粕和酵母提取物进行响应面设计分析，研究结果表明当豆粕和酵母提取物含量分别为100 g/L, 25 g/L时，果胶裂解酶活性最大为22.69 U/mL。

枯草芽孢杆菌；果胶裂解酶；中心组合设计

0 引言

果胶酶（pectolytic enzyme or pectinase）是分解果胶物质的多种酶的总称，果胶裂解酶是以反式消去作用断开果胶聚合物主链为特征，是果胶酶的重要组成部分[1]，广泛存在于细菌、真菌和放线菌等微生物。近年来果胶裂解酶在棉纺织品的生物精练、食品工业特别是果汁果酒的澄清和提高果汁出汁率等方面发挥着重要的作用[2]。目前，国内对于果胶酶的研究多数是以复合酶的形式进行，对于每种酶的具体作用其实并不清楚，有些果胶酶组分可能对于其具有抑制作用，因此，使用果胶酶单一组分具有大幅度提高果胶酶应用的价值[3]，因而开展对于果胶酶单一组分的应用研究显得尤为必要。

酶的生产成本是决定酶能否广泛使用的关键因素，因而采用发酵工程技术提高酶的产量和降低生产成本是实现酶大量和广泛应用的基础。Plackett-Burman试验设计是一种经济有效的两水平试验设计方法，该法主因素为正交设计，两因素间的交互作用仅部分与主因素产生交错作用。此设计方法虽然不能考察各因子之间的交互作用，但可以利用最少的试验次数，从众多的考察因素中快速而有效地筛选出主要的影响因子。与传统的优化方法相比，中心组合试验设计方法所需的试验组数相对较少，可节省人力物力，已经被成功地用于各种过程的优化分析中。本研究依次使用Plackett-Burman筛选试验设计和中心组合试验设计，对果胶裂解酶产生菌枯草芽孢杆菌，在摇瓶规模的发酵产果胶裂解酶的培养基组分进行优化[5-6]，为大规模生产果胶裂解酶提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌：某大学食品微生物试验室提供。豆粕粉：市场购买。咔唑：北京化学试剂公司。其他试剂均来自国药集团。

1.2 仪器与设备

HH-4型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。752紫外光栅分光光度计：上海第三分析仪器厂。GZX-GFC-101-3-S电热恒温鼓风干燥箱：上海博泰试验设备有限公司。灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。BJ-CD超净工作台（NEW TYPE CLEAN BENCH SERIES）：BOXUN CORP。精密电子天平：赛多利斯（SARTORIUS）科学仪器（北京）有限公司。移液枪：PHYSIOCARE, CONCEPT。飞鸽牌离心机：上海安亭科学仪器厂。THZ-C/TCYQ 恒温振荡器（摇床）：江苏太仓试验设备厂。UPH-40自动纯水系统：优普超纯水制造系统。

1.3 方法

1.3.1 培养基制备

斜面培养基：葡萄糖2，蛋白胨0.4，酵母提取物0.2，琼脂2.0，水100 mL。种子培养基：葡萄糖2，酵母提取物0.4，酵母提取物0.2，水100 mL。

1.3.2 枯草芽孢杆菌的发酵培养

取一环枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于37 ℃培养18 h，然后于4 ℃冰箱保存待用。将斜面上的细菌接种到高温灭菌后的种子培养基中，于37 ℃、140 r/min条件下，恒温培养24 h，然后分别接种到表2和表4的按编号配置好的培养基中，37 ℃，140 r/min培养24 h。

1.3.3 咔唑-乙醇溶液的配制

将0.15 g咔唑溶解于50 mL无水乙醇中，转移到100 mL的容量瓶中，用无水乙醇定容至100 mL。

1.3.4 果胶裂解酶酶活的测定

取上述培养结束的发酵液10 mL，在6 000 r/min下离心10 min，于4 ℃保存，分别加入聚半乳糖醛酸进行酶促反应。以聚半乳糖醛酸为底物，在235 nm处测定反应混合物的吸光值。一个标准酶活单位（IU）定义为：每分钟时间使聚半乳糖醛酸裂解产生1 µmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235 nm处的摩尔吸光系数为4 600 L• mol-1• cm-1。

1.3.5 培养基优化试验方案

本研究对11个因子（葡萄糖，葡萄糖，果糖，氯化铵，乙酸铵，硫酸铵，蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4，KH2PO4，CaCl2）进行了析因设计，得出了20组培养基组合并进行了枯草芽孢杆菌产果胶裂解酶试验，结果见表1和表2。

表1 Plackett-Burman试验设计因素水平及编码Tab. 1 Factors and codes for Plackett-Burman design

表2 筛选试验表Tab. 2 Design for factor screening experiment

在Plackett-Burman筛选试验设计的基础之上，本研究采用中心组合试验设计方法对影响果胶裂解酶生产过程中的关键因子水平及其交互作用进行了优化与评价。利用JMP软件对初选出的关键因子（豆粕、酵母提取物）进行设计和编码，得出了10组培养基配方（见表3、表4）。

表3 中心复核设计试验因素水平及编码Tab. 3 Factors and codes for central composite design

表4 中心复合设计试验表Tab. 4 Experiments for central composite design

取已经培养好的种子液20 mL，加入到按编号配置好的培养基中，在37 ℃、140 r/min条件下恒温培养24 h，制备粗酶液。

2 结果与讨论

2.1 不同因子对果胶裂解酶活影响的显著性评价

用Plackett-Berman法确定对产果胶裂解酶具有显著性影响的因子，试验结果如表2。由表2可知，在20组试验中，果胶裂解酶的活性大小由0.15 U/mL到19.07 U/mL，说明培养基的组成成分对微生物的产酶能力有显著的影响。因此，必须对培养基的组分进行优化以得到最大的产酶培养基。用Plackett-Berman筛选显著影响因子，只能考虑到多个影响因子里的主效应的影响，而无法考虑到因子之间相互作用的影响。由表5可知，对微生物产果胶裂解酶能力具有正向影响作用即促进产酶的因子是果糖（X2）、豆粕粉（X8）和酵母提取物（X5），对产酶能力具有负向即抑制产酶的因子是葡萄糖（X1）。果糖的市场价格高，考虑到成本和产酶条件的稳定性，舍去果糖。选择豆粕和酵母提取物进行响应面设计，进一步优化产酶培养基的组成。

表5 筛选试验排序参数估计值Tab. 5 Estimated values of factors for screening experiment

2.2 响应面设计培养基的优化

利用响应面设计中的中心复合设计，得到有两个中心点的响应面设计，该设计共有10组试验，如表4所示。由表4可知，果胶裂解酶活性在不同培养条件下酶活由1.24 U/mL增加到22.69 U/mL，酶活显著增加。利用软件对模型进行分析，得到实测值与预测值之间的差异图，见图1。由图1可知，实测值与预测值的误差在5 %内，R2= 0.92，说明模型预测值与实际值的线性关系良好；对模型进行方差分析，由p ＜ 0.05可知，模型中的各个因子对模型的影响显著。表6列出了各个因子对模型影响显著性的差异，由表6的p值可以看出，豆粕对模型的影响最显著。通过因子刻画器可以看出各个因子对试验模型影响的趋势，结果如图2所示。

图1 实际值对预测值图Fig. 1 Values of detection and prediction

表6 响应面设计排序参数估计值Tab. 6 Estimated values of factors for central composite design

由图2可知，各个因子对模型的影响显著性各不相同，豆粕对模型的影响呈正向曲线关系，说明当豆粕浓度达到一定量时，酶液中的果胶裂解酶活性达到最大；由表6和图2可知，酵母提取物对果胶裂解酶活性的影响不显著，与筛选试验得到的结果相矛盾，这是因为筛选试验只考虑到主效应的影响，忽略了各个因子之间的交互作用，在试验过程中引起了误差。

图2 预刻画器图Fig. 2 Prediction profiler

预测刻画器给出了各个因子单独存在时对模型的影响，通过交互因子刻画器可以看出各个因子的相互作用对试验模型的影响，结果如图3。

图3 交互作用刻画器图Fig. 3 Prediction profiler for interaction

由图3可知豆粕和酵母提取物之间两条线不相交，说明豆粕和酵母提取物之间不存在交互作用。响应曲面是各个因子的立体曲面图，通过响应曲面更为直观地显示出不同酶活下各个因子的比例及用量，如图4所示。

图4 酵母提取物和豆粕对果胶裂解酶活性影响的响应曲面图Fig. 4 Effect of yeast extract and soybean meal on pectinases activity

在响应曲面上画等高线，得到等高曲线图图5，在等高曲线图上可以清晰地看出在酶活一定的情况下豆粕和酵母提取物的不同比例，便于得到最佳比例。

图5 响应曲面等高曲线图Fig.5 Contour chart of rotational orthogonal experimental design

通过预测刻画器、相互作用刻画器、曲面图、等高线等分析得到，微生物产酶量与各种因子之间的方程为Y = 0.8A2+1.14B2+ 0.071AB − 3.763B − 8.07A + 27.23。

式中：Y-为菌株产果胶裂解酶的预测值；A和B分别为上述2个自变量的编码值。

对方程变量求导即可得到Y最大值时各个因变量的数值，也可通过软件自带的最大化意愿得到各个因子的最佳数值，结果如图6。由图6物浓度为2.5 g/100mL时，培养基酶活达到最大值22.69 U/mL。

图6 最大化意愿预测刻画器图Fig. 6 Prediction profiler for maximize desirability

3 结论

众所周知，培养基组分影响着微生物的生物量的变化和代谢产物的合成与分泌，研究培养基组分对于提高微生物的生物学特性具有重要的意义。本研究通过对枯草芽孢杆菌生产果胶裂解酶对于碳源、氮源以及矿质元素等影响因素效应的统计学分析，从葡萄糖、果糖、豆粕粉、氯化铵、乙酸铵、硫酸铵、蛋白胨、酵母提取物、K2PH04、KH2PO4、CaCl2等11个相关因子中筛选出对枯草芽孢杆菌产果胶裂解具有显著影响的因子——果糖、豆粕和酵母提取物，并进一步通过中心组合设计研究豆粕和酵母提取物的响应效应，在豆粕和酵母提取物含量分别为100 g/L, 25 g/L时，果胶裂解酶活性达到最大值22.69 U/mL。

[1] 赵政, 董云舟, 堵国成, 等. 碱性果胶裂解酶摇瓶发酵条件优化[J]. 工业微生物, 2003, 32(2): 9-14.

[2] 兰颖辉, 路福平. 果胶裂解酶液态发酵条件的研究[J]. 天津科技大学学报, 2006, 4(2): 15-18.

[3] IGLESIAS M T, LOZANO J E. Extraction and characterization of sunflower pectin[J]. Food Engineering, 2004, 62(3): 215-223.

[4] 田辉, 马力. 果胶制备方法的研究进展[J]. 中国调味品, 2007(3): 18-20.

[5] PAN H F, XIE Z P, BAO W N, et al. Optimization of culture conditions to enhance cis-epoxysuccinate hydrolase production in Escherichia coli by response surface methodology[J]. Biochem. Eng., 2008, 42(2): 133-138.

[6] REN J Y, ZHAO M M, SHI J, et al. Optimization of antioxidant peptide production from grass carp sarcoplasmic protein using response surface methodology[J]. Lwt-Food Science and Technology, 2008, 41(9): 1624-1632.

Optimization of Culture Components for Pectinase Production
by Bacillus Subtilis

YANG Xiu-song1, ZHANG Xin-ping2
( 1. State Food and Drug Administration Institute of Executive Development, Beijing 100073, P. R. China；2. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 201101, P. R. China )

A Plackett-Burman design was used to screen the significant factors from glucose, sucrose, soybean meal, NH4Cl, (NH4)2CHCOOH, (NH4) SO4, peptone, yeast extracts, K2PHO4, KH2PO4and CaCl2to affect pectinase production. Furthermore, central composite design of experiments was carried out to optimize the optimal levels of two important factor, namely soybean meal and yeast extracts. The optimum concentration levels for obtaining maximum 22.69 U/mL pectinase activity were: 100 g/L soybean meal and 25 g/L yeast extracts.

Bacillus Subtilis; pectinase; central composite design

Q815/TQ92

A

1001-4543(2012)02-0105-07

2012-04-09;

2012-05-17

杨秀松（1975－），男，北京人，工程师，硕士，主要研究方向为食品安全检测，电子邮箱yxs@sfdaied.org。