人副流感病毒入侵宿主细胞的分子机制

贺 英，薛 倩，安艳娟，胡陈莹，李姝槿，郝云霞，魏博欣

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

人副流感病毒(human parainfluenza virus，HPIV)发现于20世纪50年代末，原名仙台病毒，最初从日本仙台市一例死于肺炎的患儿肺液中分离获得。据统计，大约30% ～40%的婴幼儿急性呼吸道感染都是由HPIV引起的。HPIV1型、2型和3型是引起世界各地多数儿童义膜性喉头炎、细支气管炎和肺炎的主要原因［1］。HPIV3引起的病例占美国小儿科呼吸住院治疗病例的11%，是引起婴儿义膜性喉头炎的主要原因;而HPIV1和HPIV2倾向于感染年龄较大的儿童和青少年。其他儿童呼吸系统疾病如流行性感冒和麻疹已经通过免疫接种计划和抗病毒治疗得到某种程度的控制，也开发了一些有效的预防策略。但是对于副流感病毒，并没有有效的治疗手段，所以在预防和治疗副流感病毒方面远远落后于对其他疾病的预防和治疗。

副流感病毒的抗病毒治疗方法目前尚没有深入的研究报道，探明该病毒生命周期的特征可以发现病毒的弱点来加以攻击。HPIV通过结合受体分子来进入靶细胞，然后融合病毒包膜和宿主细胞膜进入细胞质。受体结合、细胞膜融合和进入是病毒入侵的关键步骤，所以干扰病毒生命周期从而预防疾病是目前控制病毒的主要研究策略。了解病毒入侵的分子作用机制是理解呼吸疾病的发病原理和预防治疗的基础。

1 副流感病毒及其生命周期

1．1 病毒的结构

人副流感病毒是副粘病毒科内的呼吸道病毒和腮腺炎病毒的成员。病毒为粗糙的球形，直径大约150～400 nm，有包膜。包膜在病毒出芽时由宿主细胞膜形成，由宿主细胞脂类和糖蛋白组成。包膜表面突出2种糖蛋白:一种为血球凝集素-神经氨酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase，HN)，具有红细胞凝集活性和神经氨酸酶活性;另一种为融合蛋白(fusion protein，F蛋白)，有2种亚型F1和F2，具有促进细胞融合和溶血特性。包膜内层由维持结构完整性的非糖基化蛋白组成，即基质蛋白(M蛋白)。HPIV基因组为单链负链RNA，在其翻译成蛋白质之前必须先转录成正义链。HPIV像所有的负链RNA病毒一样，在病毒粒子中编码和包装一个RNA依赖的RNA聚合酶复合体。包括紧密包绕RNA基因组的核衣壳蛋白(NP)，磷蛋白和大蛋白。RNA基因组大约15 500个核苷酸，并且被病毒核衣壳蛋白壳体化而形成螺线形RNA-衣壳蛋白复合体［2］。

1．2 病毒的生活周期

副流感病毒细胞感染的第一步是靶细胞的结合，即病毒受体结合的分子(血细胞凝集素神经氨酸酶)与细胞表面的含唾液酸的受体分子的互作。然后，病毒包膜直接与细胞质膜融合，通过病毒融合蛋白质(F蛋白质)介导并释放核衣壳进入到细胞质里［3，4］。融合后释放到细胞质的核衣壳蛋白包含与病毒核衣壳蛋白紧紧结合的基因组RNA，这种蛋白质RNA复合物是病毒RNA基因组复制和转录的模板，而复制和转录的产物最终包装成后代的病毒体。病毒基因组编码2个病毒表面的糖蛋白HN蛋白和F蛋白，参与病毒组装和出芽的基质蛋白，RNA聚合酶蛋白和RNA蛋白质壳体化的蛋白;而且通过改变RNA读码框或RNA编辑，在感染细胞中可以合成一个或多个非结构蛋白，这些蛋白可以帮助病毒逃避宿主的免疫应答。

病毒核衣壳蛋白依照一定的规则组装，新组装的核衣壳蛋白包括病毒的全长RNA基因组和聚合酶蛋白质，通过细胞膜出芽形成包括F和HN蛋白质以及基质蛋白的病毒粒子。在两极分化的上皮细胞中，病毒从细胞顶端表面出芽。基质蛋白与核蛋白壳结合并且与HN和F蛋白质的细胞质尾巴结合，用这种方法间接的排列核衣壳蛋白以及细胞膜区域的病毒糖蛋白，以便病毒出芽［5］。HN分子的神经氨酸苷酶和受体切割活性，酶切含有神经氨酸的受体分子(该分子将病毒的HN蛋白黏附到细胞表面)，从而允许新发芽的病毒粒子从细胞表面释放下来，开始进行病毒下一个周期的传染［6，7］。

2 HN蛋白在受体结合、受体切割以及激活F蛋白质融合的作用

由于副流感病毒的HN蛋白兼具红血球凝聚(唾液酸包含的受体结合)和神经氨酸酶(唾液酸包含受体的切割)活性，人副流感病毒HN蛋白质是不同于其他副粘液病毒属的受体结合糖蛋白。副流感HN蛋白质的氨基端延伸到细胞质而羧基端在细胞外，在细胞表面和病毒上由二硫键连接的二聚体组成四聚物［8］。HN分子包含胞质域、跨膜区、颈部区和球状头。新城疫病毒(NDV)的HN蛋白质和HPIV的HN蛋白的晶体结构研究表明，球状头部主要包含唾液酸结合位点和神经氨酸酶激活位点［9～11］。

除了帮助病毒吸附到细胞表面和复制后从细胞释放病毒粒子的功能外，HN蛋白与其受体的互作还是病毒感染过程中F蛋白介导的细胞膜融合所必需的［12，13］。研究发现，对大多数副黏病毒而言，HN蛋白是F蛋白介导的融合过程必需的。受体结合是这一过程的重要组成部分，F蛋白为了介导病毒和细胞膜融合需要同一种病毒的HN蛋白存在［14～16］。这可能是因为HN和F蛋白质之间的相互作用是特异的，两个蛋白的结构和特殊互作关系是维持他们功能必需的［17，18］。副流感病毒HN蛋白结合到受体上，在激活或“激活”F蛋白呈现融合准备完毕的构象中扮演重要作用［19，20］。由于激活后F蛋白的融合肽区域插入到靶细胞膜里是膜融合的关键步骤，HN蛋白的F蛋白激活效率将影响F蛋白介导融合程度和病毒入侵。

3 有包膜病毒侵入期间激活了病毒包膜与宿主细胞膜融合

所有包膜病毒进入宿主细胞都需要病毒和宿主细胞膜融合。介导该融合过程的融合蛋白在不同包膜病毒不同，这些蛋白质根据机制划为2类。I类蛋白的融合蛋白，有副粘液病毒流感血凝素蛋白，艾滋病病毒gp120融合蛋白，埃博拉病毒融合蛋白［21］。每个蛋白都是先合成形成三聚体的1个单一多肽链，然后由宿主蛋白酶切割成2个亚基，露出插入到靶细胞膜的融合肽［22～24］。这一过程激活了一系列的F蛋白构像改变，导致病毒包膜与宿主细胞膜的融合途径不同，这种不同取决于病毒进入细胞的途径以及融合是否需要在中性pH值条件下或内体内发生。流感血凝素蛋白已经成为I类融合最广泛的研究模式，内体的酸性pH值引发构象变化，允许病毒和内体膜融合［24，25］。Ⅱ类融合蛋白包括黄病毒属登革病毒包膜蛋白［26］，蜱传播的脑炎病毒包膜蛋白［27］，披膜病毒属的Semliki森林病毒E1蛋白［28］。尽管I类和Ⅱ类融合蛋白的结构有明显差异，他们通过相似的结构过渡到融合状态足以说明共同的机制［29］。

副粘病毒的融合过程发生在中性pH值靶细胞的表面，当邻近的HN蛋白结合到含有唾液酸的受体时，F蛋白质激活，允许发生融合。对于HPIV3，HN蛋白与其受体的结合激活F蛋白与靶细胞的细胞膜融合，HN蛋白改变可以改变其激活F蛋白的能力［19］。埋在F蛋白三聚体中的融合肽，为了嵌入到靶细胞膜内必须暴露出来，辅助受体结合，无论是HN蛋白或F蛋白，两者缺一不可。最新的副粘病毒F蛋白的结构和实验数据得出了I类融合蛋白在融合过程中构像变迁的模型［20，21，30，31］。该F蛋白膜锚定亚基的膜外域包含2个疏水性结构域，即融合肽和跨膜结构域。每个结构域分别毗邻HN蛋白的2个末端保守七肽重复序列(HR)区域:融合肽与N-末端HR(HR-N)相邻，跨膜域与C-末端HR(HR-C)相邻。这些HR域可以组成几个α螺旋卷曲螺旋。一旦F蛋白被激活，融合肽进入靶细胞膜内，首先产生一个短暂的“prehairpin”(前发卡)中间体，这个中间体被病毒和细胞膜固定。这种形式再折叠和组装成一个基因型6-螺旋束的结构，HR-N和HR-C联合进入一个携带N端和C端反平行排列对齐的密封复合体。由此产生的螺旋卷曲棒毗邻于融合肽，形成一个高度稳定的6-螺旋束。再折叠过程使融合肽和跨膜域的位置发生重排，从而锚定螺旋束的同一端，使病毒和细胞膜结合在一起。超螺旋结构的形成过程中，产生自由能使细胞膜与病毒包膜相互靠近，是膜融合的驱动力［20］。

通过合成对应F蛋白HR区域的多肽已经研究了HN蛋白激活F蛋白的功能。衍生自许多副粘病毒HR区域的合成肽，能够通过与F蛋白HR区域的互补结合，阻止HR-N和HR-C折叠成融合所需的稳定的6-螺旋束结构，进而抑制病毒和宿主细胞膜的融合［21，30］。这些研究表明，血凝素神经氨酸酶蛋白与含唾液酸的受体的结合引发了F蛋白构像改变［20］。有模型表明，受体结合后，经历了血凝素神经氨酸酶蛋白本身的一个受体诱导的构象变化，从而激活了F蛋白的构象变化［3，13］。使用没有HN蛋白的F蛋白融合实验结果表明，HN蛋白的存在降低了F蛋白介导的融合所需要的活化能［32］。

4 HN蛋白激活F蛋白介导的膜融合过程

血凝素神经氨酸酶蛋白有3个功能(受体结合、神经氨酸酶和F-蛋白激活)，每一个都影响病毒的融合潜力。采用系列HN蛋白突变体以确定HN蛋白3个功能对应的特异性区域，是定量检测F蛋白激活的策略［31］。HN突变体表现F蛋白激活缺陷，表明F蛋白激活是HN蛋白的一个独立功能。体外试验发现，F蛋白嵌入到靶细胞膜或细胞间融合，是病毒进入靶细胞的第一步骤;虽然不同于自然状态下人类的肺感染，HN受体结合、F蛋白质激活和F蛋白嵌入可以在上皮细胞培养或动物模型上进行机制研究。

HN蛋白突变后的病毒更具有诱导病毒与宿主细胞融合的潜力，这些改变的HN蛋白导致其增加了与受体的亲和力或降低了神经氨酸酶活性。这就说明，HN蛋白与其受体相互作用是F蛋白激活必需的。与野生型相比，增加受体亲和力或降低酶活性(受体切割)使HN蛋白与其受体保持在结合后功能状态的时间更长［18］。HN蛋白的细胞表面受体结合和神经氨酸酶活性，都可通过影响HN-受体的结合持续时间，调节F蛋白激活和融合促进。降低神经氨酸酶活性的变异病毒包含1个在HN分子茎部的突变(P111S)和1个在球状头部突变。该病毒确实是神经氨酸酶缺陷，但该突变体病毒在促进融合细胞中也是有缺陷的［18］。这表明，HN蛋白特定的激活F蛋白的功能，且这一功能区定位于该蛋白的颈部区域。

使用含唾液酸受体类似物神经氨酸酶抑制剂化合物，4-呱基-神经鞘氨脂(4-GU-DANA;扎那米韦，乐瑞萨)，研究HN蛋白的F蛋白激活功能。结果发现，4-GU-DANA可抑制HPIV唾液酸苷酶活性，但不能阻止病毒从被感染的细胞表面释放;该药物阻断了副流感病毒HN蛋白和受体间相互作用，有助于从被感染的细胞中释放新组装的病毒［33，34］。但是，通过干扰HN-受体相互作用，4-GU-DANA阻碍受体结合，从而阻止融合和病毒入侵［7，34，35］。这些有趣的发现已经刺激了科学家们设计病毒结合/进入抑制因子，治疗副粘病毒感染的兴趣。

比较野生型和突变型HN蛋白激活野生型F蛋白的能力，结果发现，来源于唾液酸苷酶缺陷/融合缺陷的病毒突变体产生的HN蛋白有2个氨基酸改变(D216N在球状头，P111S在茎上)，无论与野生的HN蛋白相比或者是仅一个突变D216N的HN蛋白相比，F-蛋白激活都比较慢。与单一突变P111S HN蛋白比较显示，这种激活延迟完全归因于P111S突变［19］。在HN茎部区域上的改变虽然没有降低受体结合活性，却大大减少了F蛋白激活。温度和pH值不允许神经氨酸酶活性的条件消除了HN蛋白神经氨酸酶活性的影响。由于F蛋白激活减少，细胞融合也明显减少［19］。含有双突变D216N/P111S HN蛋白的病毒是唯一发现的副粘病毒变种，该病毒HN蛋白的F蛋白激活功能缺陷和融合促进作用缺陷，第一次将融合缺陷明确归因于HN蛋白的激活功能缺陷，而不依赖于HN蛋白的其他功能。

5 HN蛋白调节其激活F蛋白能力的特性

在3个HN蛋白功能均可评估的条件下研究HN蛋白突变体的功能时，这些限定病毒入侵的特性之间的平衡就会变得明显［18］。在pH值接近最佳的神经氨酸酶活性(pH 5．7)时，由野生型HN蛋白引起的F蛋白激活大大减少，神经氨酸酶使靶细胞受体从HN蛋白上释放下来，激活融合发生很少。没有神经氨酸酶活性的HN蛋白(D216N/P111S的HN)，F蛋白激活的比例和程度在pH 5．7和pH 8．0(神经氨酸酶没有活性的pH值)下是相同的。这说明，对野生型 HN蛋白而言，低pH值降低了F蛋白激活，增强了神经氨酸酶的活性。双突变HN蛋白与P111S突变的HN比较揭示了HN蛋白的神经氨酸酶活性对其其他功能的影响:P111S突变HN(有残余神经氨酸苷酶活性)释放可逆结合的HN蛋白受体，不像D216N/P111S双突变的HN，通过维持长时间与受体的接触延迟启动融合［19］。在有助于增加神经氨酸酶活性的pH值(pH 5．7)下，完全丧失了由P111S HN引起的融合启动。通过比较不同神经氨酸酶活性的HN蛋白，说明了这种酶在调节F蛋白激活中起着关键性的作用:神经氨酸酶减少了HN蛋白继续与靶细胞受体接触的几率，从而避免HN蛋白受体结合启动的F蛋白激活。

为了评估受体亲和力对F蛋白激活的影响，构建了具有比野生型HN蛋白高的受体亲和力并拥有野生型神经氨酸酶活性的HN突变体(T193A)。结果发现，该突变体的F蛋白激活效率在pH 5．7和pH 8．0保持一样高，靶细胞受体释放在pH 5．7和pH 8．0一样低。这表明，较高的受体亲和力抵消了增加神经氨酸酶活性的影响。神经氨酸酶活性和受体结合亲和力都影响受体的可用性，从而影响了F蛋白激活的效率。因此，虽然HN蛋白茎部区的突变(如P111S)影响HN蛋白激活F蛋白的潜力，这种潜力也受影响HN-受体相互作用的球形头部的变化而调整。激活F蛋白完全取决于HN-受体相互作用，而且HN蛋白的每一个功能各自独立的影响HN蛋白的能力，以配合调节融合的F蛋白［18，19］。

6 HN蛋白-受体相互作用对体内发病机制的贡献

对于HPIVS，病毒感染引发的病理学反应、免疫保护反应和疾病增强的炎症反之间的相互作用并不是很清楚。在许多情况下，疾病严重程度增加，疾病的临床病理现象实际由于炎症反应而不是病毒的细胞毒效应。随着疾病症状出现的时间推移，病毒感染的宿主细胞的病毒滴度逐渐减少，而且病毒滴度和下呼吸道疾病的严重性没有相关性。采用棉鼠疾病模型分析了HPIV3体内发病机制的影响因素。模拟人类疾病，实验感染HPIV的棉鼠导致支气管上皮细胞感染和细支气管炎［36］。在研究中用野生型(WT)HPIV3和3个HN突变体感染棉鼠，3个突变型分别为:HN的T193A(高亲和力受体，球状头部突变)，HN的H552Q(高受体活性，二聚体界面突变)和HN的D216N(神经氨酸酶的活性低，球形头突变);与野生病毒相比，在感染鼠体内的变异病毒保留了变异病毒的嗜斑形态，且在感染的动物中没有发生回复为野生型的突变。出乎意料的是每个HN蛋白变化导致HPIV3引起疾病的极大不同，并且这种作用与病毒复制的影响没有关系。这些变种引起肺泡炎和间质性浸润，然而野生型病毒只引起细支气管周炎，疾病加重归因于HN的变异，HN的变异大大地增加了炎性细胞在肺泡和肺泡间质中浸润，显著的特点是肺泡壁增厚，气管内炎性细胞明显增加。这些结果表明，这些差异是由于不同HN蛋白对炎症反应的调整，而且与病毒的复制或传染性没关系［37］。

可以推测，无论是改变HN蛋白对受体的亲和力还是改变其受体切割活性都可能改变宿主的炎症反应性质。使用HN突变体详细研究增强疾病的病因，有可能明确有哪些免疫系统响应的组成部分与HPIV3引发疾病有关。事实上，初步试验表明，棉鼠感染后观察到的增强病理现象，对于每一种HN蛋白变异HPIV来说，相应的趋化因子特异性变化有特别明显的不同。HN蛋白突变改变了趋化因子的表达，这将为了解免疫与发病机制的关系提供信息，用于开发成调节HPIV3感染后过度活跃的炎症反应的治疗措施。

尽管关于人副流感病毒的HN蛋白研究报道已经不少，也初步探索了该蛋白的功能及其在致病性上的作用。仍有许多方面有待进一步了解。尤其是为什么会需要一个为了促进起始融合的HN-受体的结合，HN蛋白受体结合后发生了怎样的构象变化。了解HN蛋白如何执行其F蛋白激活功能是理解副粘病毒怎样进入宿主细胞的核心，也是进一步预防和控制儿童副流感病毒感染的潜在基础，对病毒基于HN受体结合、激活病毒包膜与宿主细胞膜融合和入侵宿主细胞的每一步深入研究，都可能提供研发抗病毒新药的靶标。

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