晚期肺腺癌外周血TS mRNA表达与培美曲塞治疗疗效的关系

孙 哲 ，余 锋 ，衣玉丽 ，章 洁 ，汪小浪

（南昌大学a.第一附属医院肿瘤科；b.护理学院；c.医学院生化教研室，南昌 330006）

在选用培美曲塞作为晚期肺腺癌患者的化疗方案时先检测患者外周血胸苷酸合成酶（TS）mRNA表达的情况来预测培美曲塞给患者带来的益处，能更加有针对性的选用化疗方案，从而进行个体化治疗。检测患者外周血TS mRNA的表达比检测肿瘤组织中TS表达更方便易行。本文应用逆转录聚合酶反应技术（RT-PCR）检测晚期肺腺癌患者化疗前TS mRNA水平并分析其与培美曲塞治疗疗效的关系,以探讨其在预测晚期肺腺癌化疗疗效方面的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择 2009年 6月至 2011年12月在南昌大学第一附属医院就诊的Ⅲ、Ⅳ期晚期肺腺癌患者29例。纳入标准:年龄＜70岁；体力状况（ECOG）评分＜2分；经组织病理学确诊为腺癌；根据UICC肺癌分期标准为Ⅲ期或Ⅳ期；未接受过手术、放化疗和靶向治疗;有可测量病灶；肝肾功能正常，无化疗禁忌，且预计生存期大于3个月；取得患者及家属同意。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol（Invitrogen 公司），逆转录试剂盒（Qiagen公司），PCR扩增试剂盒（上海生工），引物由primer premier5.0软件系统设计，TS引物序列:5’2 CTTCAGCGAGAACCCAGACC23’，5’2 TCCAGCCCAACCCCTAAAGAC23’，PCR 产物长度192 bp。

1.3 化疗方案

培美曲塞 500 mg·m-2静脉点滴，第1天;顺铂75 mg·m-2静脉点滴，第1天。21 d为1周期。用药前 24 h口服地塞米松 4 mg，2次·d-1，连服 3 d；用药前1周给予VitB121000 μg单次肌内注射，并予叶酸 400 μg，1 次·d-1，连服至培美曲塞结束后 21 d。

1.4 疗效评价

化疗2周期后按RECIST1.1实体瘤疗效评价标准评价疗效。有效组为完全缓解（CR）和部分缓解（PR），无效组为稳定（SD）和疾病进展者（PD）。

1.5 外周血TS mRNA表达检测

采用RT-PCR检测患者化疗前外周血中TS mRNA的表达水平。对所有的肺癌患者于治疗前抽取外周静脉血5 mL,EDTA抗凝。用淋巴细胞分离液分离出白细胞。按照Trizol Reagent说明提取外周血的总RNA，-70℃保存，备用。RNA-cDNA特异序列逆转录:30 ℃ 10 min，42 ℃ 35 min，99 ℃ 5 min，4℃5 min；瞬间离心5～10 s。PCR特异序列扩增:PCR 反应体系 25 μL，其中 cDNA 2 μL，10×PCR 缓冲液 4 μL，TaqDNA 聚合酶（1 U·μL-1）1 μL，4 种dNTP 混合物（2 mmol·L-1）2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，上下游引物各 0.04 μL，用无 RNA 酶去离子水定容至25 μL。以三磷酸甘油醛脱氢酶（glycer-aldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH）为内对照，与目的基因同管扩增。反应条件:94℃预变性3 min后，进行 35 个循环（94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s），4℃冷却，同时cDNA在同一反应条件下，用GAPDH上下游内引物各10 μL，同样条件30个循环，最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR产物分析:用1.5%的琼脂糖凝胶，厚度约4 mm，上样扩增产物 10 μL，每 cm 电压为 80 V，电泳 30 min，在SZD700凝胶成像系统下摄像分析。并计算目的片段的灰度，分别与其内参GAPDH的灰度作比较分析（TS/GAPDH）。

1.6 统计学方法

2 结果

化疗2周期后，根据化疗疗效分组，29例中有效组 7例（CR 1例，PR 6例），无效组 22例（SD 16例，PD 6例）。有效组外周血 TS mRNA的表达为0.66±0.12，无效组为 1.23±0.21，有效组明显低于无效组，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

培美曲塞（pemetrexed，MTA，LY231514）是基于经典的抗代谢类药物甲氨蝶呤和氟尿嘧啶基础上研制的新一代抗代谢药，由礼来公司（EliLily，Inc）研发。除FDA批准的适应证:恶性胸膜间皮瘤和非小细胞肺癌外，培美曲塞单药或联合化疗对多种肿瘤有明显的治疗作用。培美曲塞能够通过干扰叶酸代谢和DNA的合成来抑制肿瘤生长。培美曲塞的作用靶点在于嘧啶和嘌呤合成过程中的多种酶。其中之一是作用于TS，此作用与氟尿嘧啶（FU）类似，TS是胸苷酸合成中的限速酶，在DNA合成中充当着关键作用，由于对TS的抑制，故DNA合成所必须的可利用的胸腺嘧啶减少，接着就造成细胞增殖下降，特别是在快速增殖的肿瘤细胞［1］。

有4项培美曲塞与铂类药物联合一线治疗晚期NSCLC的Ⅱ期临床研究［2-5］结果表明，培美曲塞与铂类联合方案的疗效与其他常用的含铂两药联合方案相似，而毒性反应的发生率则明显较低。

化疗在癌症的治疗中占重要地位，然而化疗并非对所有的癌症患者都有效，如何使癌症化疗更具针对性、有效性、减少盲目性，已成为当前研究的热点。有很多研究证明肺腺癌中TS呈显著的高表达［6］，TS对肺癌的预后同样非常有意义。非小细胞肺癌的恶性程度也同TS的高表达有关［7-8］。既往研究表明，肿瘤内TS水平的高低能够预测TS相关治疗的疗效［9］。那么外周血TS mRNA的表达水平能不能预测培美曲塞的疗效？本研究的结果显示:临床有效（CR+PR）的患者外周血TS mRNA表达水平低于稳定（SD）和疾病进展（PD）的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，晚期肺腺癌外周血中TS转录水平对培美曲塞治疗疗效的预测有一定的价值。

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