HPV感染和HPV L1壳蛋白与宫颈癌发生关系的研究进展

张 岚，宋一民，张云汉

(郑州大学第一附属医院病理科 河南郑州 450052)

宫颈癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤，全球每年新发病例高达50余万，我国每年新发宫颈癌14余万例，占世界宫颈癌新发病例的28.8%［1］。宫颈癌的确切病因和发病机制目前虽不完全明确，但是自20世纪80年代初期，德国科学家zur Hausen等［2，3］首次从宫颈癌细胞中分离出人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)并提出HPV感染与宫颈癌的发生有密切关系这一见解之后，围绕HPV感染与宫颈癌发生关系这一热点课题，已取得了较大的研究进展。HPV L1是HPV的主要衣壳蛋白，具有特异的抗原性，在宫颈癌的发展进程中亦发挥着重要作用。

1 HPV感染与宫颈癌

1.1 HPV的结构特点 HPV是微小、无包膜的环状双链DNA病毒，由72面的蛋白衣壳包裹，含有8000个碱基对(bp)。病毒的基因组按其功能可分为:早期基因区(E)、晚期基因区(L)及非编码区(NCR)3个区。早期基因区全长4 500 bp，编码在E1，E2，E4，E5，E6，E7等6个与病毒复制和细胞转化密切有关的蛋白中;晚期基因区全长2 500 bp，由L1和L2组成，L1高度保守，L2高度可变，反映HPV抗原的多态性;非编码区全长1 000 bp，含有启动RNA合成的核苷酸序列从而调节基因的表达。在E1，E2，E4，E5，E6，E7等6个与病毒复制和细胞转化密切有关的蛋白中，E6和E7为癌蛋白，是高危型HPV致癌的主要转化基因，该类基因体外转染某些细胞系后，可致使细胞永生化或恶变。HPV的E6和E7整合于宿主细胞基因组内是导致宫颈癌发生的关键因素［1，4］。

1.2 HPV的流行病学及分型 在zur Hausen提出HPV可引发宫颈癌观点的启示下，Walboomers对世界22个国家的1 035例宫颈癌标本进行检测，发现HPV的检出率高达99.7%，提示，HPV感染不仅在全球广泛存在，而且进一步证实HPV与宫颈癌的发生关系密切勿容质疑［5］。到目前为止，已分离鉴定出100余种HPV，其中40种HPV可感染生殖系统［4］，主要通过皮肤和粘膜途径感染［6］。根据HPV致癌能力的强弱不同，可将众多类型的HPV分为高危型和低危型2类，HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等被认为是高危型HPV，其中HPV 16、18最重要; HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等被认为是低危型HPV，其中HPV 6、11最重要［7］。

1.3 HPV感染与宫颈癌的发生 流行病学调查发现，在性生活活跃的妇女人群中，一生中都有可能感染HPV，但是，大多数免疫力正常的妇女在HPV感染后2年左右会自然缓解或转为阴性，只有少数免疫力低下或HPV持续性感染者，才有可能导致宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宫颈癌的发生［8］，表明HPV感染虽然与宫颈癌的发生密切有关，但不会导致免疫健全的宿主必然发生癌变，提示宫颈癌发生过程中除HPV感染外，还有其他协同因子发挥作用［9］。HPV感染是否引起CIN或宫颈癌还与感染的HPV类型有关，感染高危型HPV的妇女，其宫颈癌的发病率比一般人群高300倍［10］。

1.4 HPV感染的致癌机理 虽然HPV感染是引发宫颈癌的重要因素，但是绝大部分感染者表现为亚临床性或自限性感染，约90%的感染者可清除HPV而自愈，引起宫颈癌的几率甚少。HPV感染后，一般常经历一个无症状的潜伏期，此时病毒基因组DNA在染色体外以游离形式存在。当宿主免疫低下、病毒致病力较强或病毒持续感染时，病毒即开始大量复制。病毒复制的方式有两种:一种是病毒DNA继续以游离方式存在于细胞核内，另一种是病毒DNA整合到宿主细胞核DNA中。前者一般引起宫颈良性病变或宫颈癌前病变，只有当HPV基因组DNA整合到宿主细胞核DNA中时，才给HPV的致癌提供了重要条件。

HPV基因组DNA整合到宿主细胞核DNA后，其致癌作用与E6和E7基因的作用密切有关。E6和E7基因是分别编码为含150个和100个氨基酸的病毒原癌蛋白，是致癌型HPV的主要转化基因。研究表明，HPV E6蛋白一方面可与肿瘤抑制基因产物P53蛋白相结合，通过P53的泛素化及蛋白水解，使P53丧失对肿瘤的抑制作用及转录性质［11］;另一方面E6蛋白可作用于Paxillin蛋白及干扰素调节因子，进而阻断病毒对INF-β的诱导作用［12］;此外，E6蛋白还可使恶变的细胞对TNF-α介导的AP复合物的变化不产生反应［13］。HPV E7蛋白是一种核蛋白，可与视网膜母细胞(retinoblast，Rb)基因蛋白相互作用，继之从Rb基因复合物中释放出EF2转录激活因子，在EF2作用下启动细胞周期相关基因的活化，使细胞进入细胞周期的分裂期［14］。因此，E6基因引起的p53降解和E7基因导致的Rb基因功能变化是HPV引发宫颈癌的核心致癌机理。Frega［15］对不同年龄组宫颈上皮内瘤变的病人进行E6/E7 mRNA检测，发现E6/E7 mRNA检测是预测HPV病毒活性是否有意义的生物学标志，对30岁以上伴有细胞学异常或上皮内瘤变病人的预后判断更有价值。

2 HPV L1壳蛋白与宫颈癌发生的关系及检测意义

2.1 HPV L1壳蛋白的生物学特点 HPV的晚期基因区(L)位于HPV DNA序列的下游，含有两个开放阅读框架。其中HPV L1编码的HPV L1壳蛋白是HPV的主要衣壳蛋白，在所有类型的HPV中，HPV L1壳蛋白具有高度保守性的特点;而HPV L2编码的HPV L2蛋白是一个形体较小的衣壳蛋白，在不同类型的HPV中高度变异。HPV L1衣壳蛋白为对称的20面体，直径50～55 nm，由72个壳蛋白单位组成，其分子量约55 KD［16］。现已证明，L1壳蛋白是HPV复制早期的结构蛋白［17］，在HPV的早期复制阶段L1壳蛋白呈阳性表达，而当HPV DNA整合到宿主细胞DNA后，L1壳蛋白则呈阴性反应。HPV L1不仅可以自我组装成具有良好抗原性和免疫原性的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，而且具有免疫细胞识别的表位，是免疫细胞杀伤HPV的攻击位点，不仅是研究HPV疫苗的重要靶抗原，而且是反映宫颈病变程度及预测宫颈病变发展进程的重要生物学标志［18，19］。

2.2 HPV L1壳蛋白的检测方法及判断标准 HPV L1壳蛋白是HPV感染复制早期的结构蛋白，在HPV复制的早期阶段呈阳性表达，当HPV DNA整合到宿主细胞核DNA后则表达缺失而呈阴性表达［17］。由于宫颈鳞癌多经过CIN而呈现多阶段的发展模式，而HPV L1壳蛋白的检测能预测HPV感染后CIN的发展及预后，可防止对某些CIN患者的过渡治疗，因此HPV L1壳蛋白的检测已受到广泛的重视并应用于临床。

HPV L1壳蛋白检测通常采用免疫组织/细胞化学方法［16］。最近美国爱迪旺公司推出的赛泰人乳头瘤病毒L1蛋白检测试剂盒，是以非同位素标记核酸分子杂交技术和免疫组织/细胞化学技术为基础，同时在核酸水平和免疫水平双重检测HPV L1的方法，不仅可检测HPV L1的壳蛋白表达，而且可检测其DNA的表达。该技术可识别HPV16、18、31、48等与宫颈癌发生有关的多种HPV L1壳蛋白。由于HPV L1壳蛋白为核蛋白，只有当胞核呈红色时才是特异性染色，其他部位红染均为非特异性染色。在视野中仅发现一个胞核呈红色着色即可诊断为HPV L1阳性［20，21］。为保证诊断的特异性，每次试验应设立阳性对照(湿疣组织或细胞)和阴性对照(不加HPV抗体)［22］。

2.3 HPV L1壳蛋白检测的价值及机理

2.3.1 HPV L1壳蛋白检测的价值:20世纪90年代Mclean等发现，宫颈上皮内瘤变的进展程度与HPV L1蛋白的表达密切相关，HPV L1蛋白的表达可反映宫颈上皮内瘤变的发展及预后［23］。此后，围绕HPV L1壳蛋白检测与HPV感染引发宫颈相关病变的关系进行了大量的研究。研究表明，在宫颈上皮内瘤变患者的细胞或组织中，随着CIN级别的增加或病变的加重，HPV L1壳蛋白的表达依次降低，而在宫颈鳞癌组织或细胞中HPV L1壳蛋白呈阴性表达［16，20，23］。结果提示，HPV L1壳蛋白检测不仅可了解HPV感染后机体的免疫状况，又可作为宫颈病变预后的判断指标［23，24］。Rauber等对279例高危型HPV阳性CIN涂片中的HPV L1壳蛋白进行检测，并通过25个月的随访发现:HPV L1阳性患者中49.1%自然消退，41.5%病变无明显进展，仅9.4%的病例其病变显示进展;而在HPV L1阴性患者中，33.3%自然消退，40.7%病变无明显进展，但是有25.9%的病例其病变显示进展［25］。Griesser等［26］的研究显示，HPV L1壳蛋白的表达缺失主要出现在高危型HPV感染所致的重度CIN病例。以上研究均提示，HPV L1阴性患者更具有恶变发展的趋势，应对该类病人采取积极的治疗以防止病变的恶化［20］。

对宫颈病变进展及预后判断的检测，除HPV L1壳蛋白外，近年来提倡HPV L1与P16NK4a的联合检测。相关研究表明，在CIN病变中，HPV L1壳蛋白的阳性率随病理分级的增高而逐渐降低，而P16NK4a的阳性率随病理分级的增高而逐渐升高，HPV L1壳蛋白和P16NK4a均可作为宫颈病变程度和发展趋势的预测指标，当检测发现P16NK4a+/HPV L1-时，提示宫颈病变具有较高地恶变趋向［27－29］。Balan等［30］认为，HPV L1、P16和COX2联合检测对预测宫颈上皮内瘤变的发展进程更有价值。

2.3.2 HPV L1壳蛋白表达预测宫颈病变进展的机理:HPV感染首先侵犯鳞状上皮的基底细胞，侵入基底细胞后立即脱去衣壳，HPV的环状DNA进入基底细胞的核内，在核内游离DNA的复制受到严格的控制并与宿主细胞的复制周期相一致。当感染HPV的基底细胞逐渐分化并向表层移动到鳞状上皮中间层时，HPV DNA大量复制并产生大量HPV DNA拷贝。当上皮进一步分化达到中上层时，开始形成HPV L1壳蛋白。而HPV L1壳蛋白是公认的免疫反应攻击HPV和受染细胞的主要位点，因此HPV L1壳蛋白在鳞状上皮中上层形成后，即可通过机体的免疫监视而抑制宫颈病变的进展，此也是在HPV L1检测时HPV L1阳性细胞主要位于鳞状上皮中上层或表层的原因。相反，当HPV进入基底细胞后其DNA与胞核DNA整合后，则不能形成HPV L1壳蛋白，机体失去对病毒的免疫监视，HPV L1壳蛋白呈阴性表达，提示宫颈病变具有向恶性发展的潜能［31］。

3 结语及展望

HPV虽然是导致宫颈癌的主要因素，但并非HPV感染后均引起宫颈的相关病变或癌症，其中宿主的免疫状况亦发挥重要的作用。HPV L1壳蛋白检测不仅可预测HPV感染后宫颈病变的进程及预后，而且通过检测可制定正确的治疗方案，避免对某些CIN患者的过度治疗。此外，HPV L1壳蛋白具有明显的抗原性并且是免疫细胞杀伤HPV的主要攻击位点，以其作为靶抗原而制作的HPV预防性疫苗(Gardasil疫苗)已经取得了巨大的成功［32］，虽然HPV的治疗性疫苗正在探索研究之中，如能开发研制成功并投入临床使用，通过HPV感染防治这条轴线对宫颈癌进行系统性的研究将具有良好的前景。

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