伪狂犬病病毒Us3基因编码蛋白的功能研究进展

郭广君，吕素芳，毕研丽，肖跃强，沈志强*，丁 壮

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；3.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)Us3基因编码丝/苏蛋白激酶(Us3PK)[1]。最近研究表明Us3PK与介导病毒抗宿主细胞凋亡关系密切，Us3PK诱导的宿主细胞形态学变化与病毒在细胞间的传播能力密切相关。近年来还发现Us3PK通过磷酸化细胞内效应蛋白调控病毒自身的复制，影响病毒核衣壳的包裹，干扰MHC I抗原呈递途径等[2]，本文主要介绍Us3PK在病毒侵染细胞动力学中的作用，综述Us3PK在病毒与宿主细胞互作中的功能研究进展。

PRV的Us3基因属于病毒增殖的非必需基因，也是重要的毒力基因。Us3基因的开放阅读框的核苷酸长度为1002 bp～1170 bp，编码334～390个氨基酸的Us3PK，该蛋白在疱疹病毒家族中高度保守[3]。具有自磷酸化活性，pH9.0～9.5时酶活性最高，而且酶活性区域倾向于结合富含碱性氨基酸残基的底物，多种PRV蛋白和宿主蛋白如 UL34、Bad及 Bid等为 Us3PK的底物。PRV Us3PK的主要功能为：①在病毒侵染宿主细胞过程中与病毒毒力相关；②介导细胞形态和亚细胞结构的改变，导致细胞骨架肌动蛋白应力纤维解聚；③引起细胞核内效应蛋白的磷酸化，调控病毒自身的复制速率；④影响病毒核衣壳的包裹；⑤参与识别不同细胞类型，调节抗原递呈复合物MHC I递呈抗原。

1 Us3PK在病毒侵染宿主细胞过程中与病毒毒力相关

Olsen等采用一个隔离培养体系，通过从神经元到PK15细胞及轴突介导的PRV感染蔓延，研究了Us3PK对啮齿类动物毒力强弱和病毒侵染过程中的定位[4]。在Us3基因缺失的情况下，突变株比野生型病毒毒力降低约10倍；在PRV侵染啮齿类动物眼组织中，Us3基因缺失突变株的毒力略有减弱，Us3基因缺失突变株的毒力表现为迟发型，但症状的严重程度随时间的延长而增加，直到接近野生型病毒。Us3基因缺失突变株也可以造成神经损伤，在支配眼组织的传出和传入神经传导路中蔓延。但在体外培养的轴突周围神经系统及神经元的病毒定位没有明显的区别。

2 Us3PK介导的PRV抗宿主细胞凋亡

PRV在宿主细胞内长期潜伏感染与其反复激发抗凋亡功能密切相关。细胞凋亡主要由内外两条途径启动，单纯疱疹病毒(HSV)Us3PK的抗凋亡活性也与之相关。

2.1 Us3PK影响细胞凋亡外部途径相关因子的活性 在细胞凋亡的外部途径中，氨基末端激酶(JNK)的活化即可触发细胞凋亡的启动。研究表明，Us3基因的表达可显著抑制山梨醇诱导的细胞凋亡，Us3PK抑制了山梨醇诱导的JNK磷酸化[5-6]。此外，当Us3PK表达上调时，JNK上游激酶MKK4/SEK1磷酸化明显减弱，表明Us3PK抑制了MKK4/SEK1的磷酸化，并还可抑制MKK4/SEK1上游激酶MEKK1的活性，实现外部途径上游阻断细胞凋亡。

2.2 Us3PK影响细胞凋亡内部途径相关因子的活性 在细胞凋亡的内部途径中，Bcl-2家族成员包括Bax、Bid、Bad等多个蛋白是关键的调节因子。Us3PK可阻断Bad过表达引发的细胞凋亡，其抗凋亡作用与Bad Ser112及Ser136磷酸化有关。体外激酶测定表明，Bad确可被Us3PK磷酸化。Cartier等发现Us3PK可阻断Bid过表达介导的细胞凋亡，并能够阻断Bax过表达诱导的细胞凋亡，这表明Us3PK也可以作用于Bad的下游因子[7]。然而，激酶失活突变PRV株的感染实验表明不依赖于Us3PK的磷酸化，凋亡途径依然能够被阻断。因此，Us3PK介导病毒抗凋亡是基于其催化活性。而Us3PK催化活性的调节在病毒与宿主细胞互作用过程中具体的调节方式和调节过程还有待于更加深入的研究。

3 引起细胞形态和亚细胞结构的改变，导致细胞骨架肌动蛋白应力纤维解聚

Us3PK可以导致细胞骨架肌动蛋白动力学改变，如肌动蛋白应力纤维的解聚和病毒囊突的形成，这些均与提高病毒扩散的能力有关。

Broeke等通过转染PAK1-/-和PAK2-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的研究表明，Us3PK通过抑制在Cdc42/Rac1 Rho GTP酶信号转导通路的起关键调节作用的Ap21基因激活蛋白激酶(PAKs)，从而引起Us3PK介导的肌动蛋白的改变[8]。Us3PK介导的应力纤维解聚需要PAK2的参与，其介导的病毒囊突的形成主要是PAK1起作用，表明PAK1与PAK2对肌动蛋白细胞骨架组织具有不同生物学效应。采用PAK1-/-和PAK2-/-MEF培养病毒，病毒表现为较低的蔓延速度。因此，Us3PK是通过结合和磷酸化蛋白激酶A来影响细胞骨架肌动蛋白。Minnebruggen等认为细胞骨架有利于病毒的复制和传播，PRV经猪肾脏细胞(SK-6)培养，可以诱导SK-6肌动蛋白压力纤维分解。在其研究中，采用不同的PRV缺失突变体感染不同的细胞，结果发现，Us3PK在不同的PRV缺失株感染的细胞系中参与肌动蛋白应力纤维的解聚。此外，通过转染实验还表明在缺少PRV其他蛋白的情况下，大量的PRV Us3PK定位于核内，并能够触发肌动蛋白纤维的解聚[9]。Broeke等发现Us3PK在病毒侵染中的作用包括调节肌动蛋白细胞骨架，抑制细胞凋亡和调节病毒颗粒从核孔释放[10]。但对Us3PK发挥其功能的机制仍然知之甚少。最近，他们确定了A p21基因激活激酶PAK1和PAK2在Us3PK的介导的细胞骨架重排的重要效应。PAKs与Us3PK的抗凋亡特性有关[11]。采用野毒和Us3缺失PRV毒株感染野生型MEF、PAK1-/-MEF和PAK2(-/-)MEF显示，PAK2在感染过程中在Us3PK介导的抑制细胞凋亡过程没有任何作用，而PAK1却起到一定的作用。这些结果表明，PAK1在Us3PK的抗凋亡活性中发挥了显著而有限的作用。

4 引起细胞核内效应蛋白的磷酸化，调控病毒自身的复制速率

Erazo等发现HSVⅠ型(HSV-Ⅰ)、PRV和水痘带状疱疹病毒(VZV)ORF66激酶与Us3PK影响到一些病毒与宿主细胞的相互作用。他们通过HSV-1的Us3PK的基序与细胞中蛋白激酶A(PKA)的重叠促使一种PKA的抗体底物磷酸化，以此确定 Us3PK/ORF66激酶作用靶标[12]。HSV、VZV和PRV促进不同的Us3 PK/ORF66激酶依赖。VZV的Us3PK主要磷酸化125 ku蛋白被确定为核基质蛋白3(主要的核基质蛋白之一)。核基质蛋白3也是一个Us3PK的磷酸化激酶依赖性激酶。核基质蛋白3可以被HSV、PRV的Us3PK和VZV的ORF66激酶所磷酸化，由于VZV直接磷酸化效应蛋白T150没有被PKA抑制剂所阻断，也没有因PKA的活化而诱导，PKA主要磷酸化核基质蛋白3的S188位点，这表明VZV磷酸化效应蛋白T150是非依赖PKA的。然而，纯化的VZA ORF66激酶在体外没有磷酸化核基质蛋白3的活性，这意味着其磷酸化过程需要更多的细胞因子辅助[13-14]。在缺失ORF66激酶的VZV感染细胞中，核基质蛋白3显示细胞核内的变化，在缺失Us3PK的HSV-1或PRV感染的晚期细胞的细胞质中核基质蛋白3显示分布明显发生变化。这项研究表明，核基质蛋白3的磷酸化是这一类磷酸激酶的潜在靶点。Walters等通过转染表达Us3PK的重组质粒或HSV-1、VZV和PRV病毒都会引起组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的磷酸化，并且每个Us3PK磷酸化位点位于HDAC2相对保守的C端丝氨酸残基上[15-16]。在缺失Us3PK的PRV感染的细胞中HDAC2也过度磷酸化，这表明由PRV引起的HDAC2过度磷酸化与不依赖Us3PK磷酸化的的方式进行。利用特定化学抑制剂抑制HDAC1活性可以增加缺失了Us3PK的VZV和PRV的蚀斑数目，而对野毒的蚀斑数目影响不大，表明VZV和PRV Us3PK的靶标为组蛋白去乙酰化酶，以减少病毒基因组的沉默并进行高效率的病毒复制。然而，在HSV-1中没有这一现象发生，表明尽管HDAC2是HSV Us3PK磷酸化靶标，其磷酸化与否由其病毒的特异性决定。Deruelle等研究发现虽然在缺失Us3PK的情况下PRV和HSV侵染一些细胞系造成病毒滴度的降低并延迟了细胞的凋亡，但在猪睾丸细胞和人喉上皮细胞分别培养的缺失Us3PK的PRV和HSV或两者野毒，利用细胞凋亡蛋白酶阻断剂阻断细胞凋亡途径，并不能影响病毒的出膜和病毒滴度[17]。Skiba等利用缺失Us3的PRV和野毒感染牛肾细胞，然后分离亚细胞组份细胞核和细胞质，通过双向电泳和质谱技术分析蛋白质表达水平，结果表明有两个55 ku蛋白表达水平明显增高，其中磷酸化修饰在蛋白表达调控中起到重要作用，能够明显增加主要的DNA结合蛋白(UL29)和核糖核苷酸还原酶大亚基(UL39)的表达水平，降低DNA聚合酶促进因子(UL42)的表达水平[18]。Poon等发现Us3PK通过磷酸化作用阻止组蛋白的去乙酰化，调控基因的表达[19]。

5 影响病毒核衣壳的包裹

PRV最初的被膜由核膜内部小叶捕获并通过核膜外运小叶转运至细胞质中，而缺失Us3PK会导致后一过程受到影响[20-21]。释放到细胞质中的包膜和病毒衣壳蛋白穿过高尔基体囊泡，释放成熟的具有感染性的病毒粒子，并通过转运小体释放到质膜外[22]。在形成最初病毒体的阶段，在PRV、HSV-1和鼠科巨细胞病毒中UL31和UL34蛋白起着重要作用[23-26]。而在缺失Us3PK的情况下，病毒核衣壳初始物会聚集在核膜周围，核衣壳的进一步包裹和成熟受到影响[27-29]。尽管Us3PK可以磷酸化UL34蛋白，但其磷酸化水平并没有因为Us3PK的缺失而有所改变[30-31]。

6 干扰MHC I抗原呈递途径

许多疱疹病毒通过影响MHC I抗原呈递途径来减少细胞毒性T细胞的清除作用，在最大的单疱疹病毒亚科中，两种高度同源蛋白抑制MHC I细胞表面抗原的表达：牛疱疹病毒 1型(BoHV-1)、PRV、EHV-1 UL49.5蛋白和VZV Us3PK。PRV降低MHC I细胞表面抗原的表达依赖于感染细胞的类型[32]。在ST细胞中，Us3PK表现其酶活性但不影响MHC I细胞表面抗原，而在PK-15和肺泡巨噬细胞Us3PK的酶学活性不是必需的，在PK-15细胞中依赖UL49.5。研究表明由PRV介导的MHC I细胞表面抗原的改变依赖于细胞类型，并且Us3PK和UL49.5蛋白可能与未知的早期病毒调控蛋白在这一过程中起到重要作用。

7 结束语

Us3基因为PRV的非结构基因，其编码产物Us3PK具有多功能性，与病毒侵染过程中抗细胞凋亡及病毒衣壳蛋白的包装及在细胞间扩散传播密切相关，介导细胞形态和亚细胞结构的改变，导致细胞骨架肌动蛋白应力纤维解聚，引起细胞核内效应蛋白的磷酸化，调控病毒自身的复制速率，干扰MHC I抗原呈递途径等。进一步研究PRV Us3基因的功能及作用机制，这些研究结果为阐明PRV及相关疱疹病毒侵染细胞动力学或净化该类病毒提供相应的实验依据。

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