表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达

常晓飞，赵双成，田 石，柳金雄，王靖飞，曾显营，胡永浩，姜永萍*，陈化兰*

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730007；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与技术服务中心，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽流感(Avian influenza)是由A型流感病毒(AIV)引起的使患病禽类表现严重的呼吸困难、产蛋力降低及隐性感染的一种禽类常见疾病[1]。其中H5亚型高致病性AIV由于具有致死率高的特点，对养禽业和公共卫生安全造成了严重的威胁[2-4]。

血凝素蛋白(HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，研究表明，HA参与流感病毒和宿主细胞的吸附过程，HA蛋白的裂解也与流感致病性有关[5]，抗HA的抗体可以中和病毒的感染力。近年来研究表明基于HA蛋白的基因工程疫苗具有良好的免疫效力[6-9]。为研究表达AIV同义HA基因编码蛋白对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护，我们构建表达H5亚型同义HA基因(Cons-HA5)的重组表达质粒pCACons-HA5，对该真核重组表达质粒在不同时间段的表达情况进行了研究，以期为进一步对pCACons-HA5的免疫效力的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞及质粒 大肠杆菌JM109感受态细胞购自北京庄盟生物公司；293T细胞以及真核表达质粒pCAGGS由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 DNA分子量Marker，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；限制性内切酶以及连接酶购自于NEB公司；DNA胶回收试剂盒及小量质粒DNA提取试剂盒购自于OMEGA公司；组织细胞裂解液、FITC标记兔抗鸡IgG(FITC-IgG)及HRP标记羊抗鸡IgG(HRP-IgG)均购自Solarbio公司；Lipofectamine 2000 Reagent购自Invitrogen公司；H5亚型AIV多克隆抗体由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室保存。激光共聚焦显微镜(TCS，SP5)为德国Leica产品。

1.3 同义H5亚型AIV的HA氨基酸序列及分析根据NCBI流感数据库中5000条H5亚型AIV的HA全长氨基酸序列，采用Clustal W1.8.3进行多序列比对及分析，按70%的同源性为标准获得一条同义氨基酸序列，并命名为Cons-HA5，将其相应的核苷酸序列的密码子优化为鸡体偏嗜的密码子，通过人工合成获得一个H5亚型同义Cons-HA5基因，优化后的Cons-HA5基因由金斯瑞生物公司合成。

1.4 pCACons-HA5真核表达质粒的构建 将合成的Cons-HA5基因定向克隆于真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ和SmaⅠ位点，构建的重组表达质粒pCACons-HA5用酶切和PCR鉴定其正确性。

1.5 激光扫描共聚焦显微镜观察转染后不同时间Cons-HA蛋白在293T细胞的表达 根据LipofectamineTM2000操作说明书的方法将pCACons-HA5转染到293T细胞，分别在转染后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h、32 h和48 h用4%的多聚甲醛溶液在室温下对细胞固定1 h，用5%的BSA封闭1 h；以H5亚型阳性血清为一抗(1∶500)；避光条件下加入用1%BSA稀释的兔抗鸡IFTC-IgG二抗(1∶2000)，采用50 mg/mL的DAPI避光条件下37℃作用15 min进行细胞核染色；将不同时段的转染细胞置于激发光为λ488nm的共聚焦激光显微镜下进行观察。

1.6 pCACons-HA5表达蛋白的western blot鉴定将转染pCACons-HA5的293T细胞，分别在转染后24 h和48 h收集细胞，经组织/细胞裂解液和超声波进行裂解。2500 r/min离心10 min，取上清进行12%SDS-PAGE凝胶分离随后进行转膜处理1 h，用5%的脱脂乳对NC膜进行封闭处理。以抗AIV多克隆抗体为一抗(1∶300)以羊抗鸡HRP-IgG为二抗(1∶5000)，采用DAB显色液进行检测。

2 结果

2.1 pCACons-HA5的构建 将人工合成的cons-HA5基因克隆于pCAGGS真核表达载体中，将重组质粒pCACons-HA5经EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳分析得到约为1700 bp和4700 bp的两个条带，经ScaⅠ单酶切处理后得到了约为6400 bp的一个条带；用特异性引物进行PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳分析可见约1700 bp的特异性片段(图1)，与预期值相符。

图1 质粒pCACons-HA5的酶切分析和PCR鉴定Fig.1 Identification of pCACons-HA5 by restriction enzyme digestions and PCR amplification

2.2 pCACons-HA5表达蛋白在细胞内的定位 通过激光扫描共聚焦显微镜观察pCACons-HA5转染到293T 细胞 2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h后Cons-HA5在细胞的表达及分布情况。在转染pCACons-HA5后2 h在细胞质内有绿色荧光分布，4 h后在细胞质及细胞膜处可见绿色荧光分布，6 h后在细胞膜处可见较明显的绿色荧光分布，直至转染质粒48 h在细胞膜处可见十分明显的绿色荧光分布(图2)。

2.3 Western blot鉴定结果 Western blot检测结果表明，pCACons-HA5转染293T细胞后24 h和48 h，在70 ku处均出现明显条带。Western blot检测到Cons-HA5蛋白在293T细胞中获得表达(图3)。

3 讨论

AIV的HA蛋白在病毒侵入细胞的过程中起着重要的作用，并且是AIV最主要的保护性抗原[10]。由于HA基因的高突变率，在一定条件下有发生疫苗株与主要流行病毒株不完全匹配的可能性。本研究经多条H5亚型AIV的HA氨基酸序列进行比对分析，得到一条同义HA蛋白序列Cons-HA5，构建出重组表达载体pCACons-HA5，以期为有效防控不同抗原群的H5亚型禽流感提供一定的思路。

图2 Cons-HA5蛋白在293T细胞中的定位Fig.2 Localization of protein of Cons-HA5 in 293T cells

图3 Cons-HA5蛋白的western blot分析Fig.3 Identification of the Cons-HA5 expression by western blot

本研究通过激光扫描共聚焦显微镜观察pCACons-HA5转染到293T细胞不同时间段后Cons-HA5蛋白在细胞的表达及分布情况。当重组质粒pCACons-HA5转染于真核细胞后2 h开始在细胞质内表达，当转染4 h后蛋白就已在膜表面开始表达，并随着转染时间的推移，该蛋白在膜表面表达的量也就越来越明显，同时研究表明流感病毒在感染宿主细胞后HA蛋白就可由内质网合成，合成后向高尔基体运输，最后通过高尔基体到达细胞表面。这一合成并转移的过程在流感病毒感染细胞后2 h～4 h内发生[11-12]，在病毒感染宿主细胞后2 h～4 h便可以检测到有HA蛋白在宿主细胞膜上的表达，这一时间正与pCACons-HA5在293T细胞中开始合成与表达的时间相吻合。由此表明pCACons-HA5转染真核细胞后蛋白的合成、转移及表达情况与流感病毒相类似。但关于该重组质粒作为疫苗使用的免疫效力及免疫该重组质粒后使机体能够产生有效免疫力的最短时间的判定等一系列问题仍需要进一步研究。

总之，本研究构建了表达H5亚型同义HA蛋白的重组表达质粒pCACons-HA5，并通过观察其在293T细胞中的表达定位以及所表达的Cons-HA5蛋白的western blot验证，表明pCACons-HA5具有相关的生物反应活性，为进一步的免疫效力研究奠定了基础。

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