microRNA在乳腺癌诊断及预后判断中的作用

曹志刚 综述 邵志敏 审校

复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

2008年全球乳腺癌新发病例138万，占女性癌症发病总数的23%；46万人死于该病，占女性癌症死亡人数的14%［1］。在中国的上海等大中城市，乳腺癌患病率已连续20年位居女性恶性肿瘤第一位［2］，严重危害广大女性的健康。近年来研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)分子调控人体基因组内约1/3的基因表达［3］，其与乳腺癌的发生、发展、侵袭及转移密切相关［4-6］，这对进一步认识乳腺癌的发病机制、诊断、治疗和预后判断都有重要意义。目前已知影响乳腺癌预后的因子有多种，主要分为临床病理学和生物学两类。生物学因子主要表现在DNA和RNA水平，而miRNA作为一种新型的肿瘤标志物因其特殊的稳定性及特异性已显示了特有的优越性。本文就miRNA在乳腺癌诊断及预后判断中的作用作一综述。

1 miRNA分子概述

miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾的pri-miRNA。这些pri-miRNA在RNase Ⅲ Drosha和其辅助因子Pasha的作用下，被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA前体产物。在核膜转运蛋白的帮助下前体分子被输送到细胞质中。随后另一个RNaseⅢ Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的双链。这种双链很快被引导进入RNA诱导沉默复合体(miRISC)中，成熟的单链miRNA保留在这一复合物中［7-9］。

目前的研究认为miRNA主要通过两种机制进行基因表达的调控［10］，①miRNA序列与靶基因mRNA的3'端非翻译区(3'untranslated region，3'-UTR) 结合，如果两者碱基序列完全互补，miRNA则促使靶基因的mRNA发生降解；②miRNA与靶基因mRNA的3'-UTR的结合，碱基序列不完全互补，则阻止靶基因mRNA的翻译，但不影响其稳定性。miRNA的表达失调，可引起大量相关基因的表达异常，导致细胞功能的紊乱，甚至出现癌变。

应用miRNA芯片技术和实时定量PCR等方法检测乳腺癌及癌旁组织miRNA的差异性表达，可发现一些与乳腺癌相关的miRNA。Calin等［11］通过分析miRNA在染色体上的定位与肿瘤发生的关系，发现186个miRNA基因中15个miRNA定位于10个与人类乳腺癌相关的缺失区。Iorio等［12］运用miRNA基因芯片及Northern blot等方法对76例乳腺癌样本和10例乳腺正常标本进行miRNA表达谱分析，发现29种miRNA的表达有显著变化，且有15种miRNA可以明确区分肿瘤或正常乳腺样本，其中miR-10b、miR-125b和miR-145在大多数乳腺癌组织和细胞中显著低表达，而miR-21和miR-155表达量则明显下降。这表明在肿瘤发生、发展过程中，起癌基因与抑癌基因作用的miRNA都发挥着至关重要的调控作用，此外也揭示这些miRNA与乳腺肿瘤的分级、分期、血管侵袭性及肿瘤细胞增殖和雌、孕激素的表达等临床病理指数均相关。越来越多的研究证实，miRNA与乳腺癌的侵袭转移也密切相关，miR-21、miR-10b、miR-373、miR-520c等在转移性乳腺癌中表达上调，促进乳腺癌的侵袭、迁移［13-15］；而miR-31、miR-126、miR-335在转移性乳腺癌中表达明显下调，体内实验发现其可以抑制乳腺癌的转移［16-19］。有趣的是，miR-200家族在肿瘤转移过程中扮演了一个“两面派”的角色［20］，一方面miR-200s能减缓原发性乳腺癌细胞向血液循环系统的初始逃逸，抑制这个过程中癌症的扩散速度；另一方面当癌细胞已经逃逸时，寻找新的“殖民地”(如肺部)的时候，这个相同的小分子竟又能够帮助促进这个过程。

2 miRNA与乳腺癌的诊断

现有研究已经显示miRNA可作为“癌症指纹”，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本较低的优点，是一种新型的肿瘤生物标志物，在肿瘤的诊断中有潜在的应用价值。

2.1 组织miRNA表达与乳腺癌的诊断

Rosenfeld等［21］报道了基于253例不同肿瘤样本的48种miRNA 表达谱结果，根据上述结果对转移灶进行的双盲验证发现，基于miRNA的未知来源转移灶分类的准确性超过了90%，显示miRNA在肿瘤诊断中的巨大应用前景。Yan等［22］分析了113例乳腺癌标本的miRNA表达谱，在这些异常表达的miRNA中，miR-21的上调最明显，同时还发现，miR-21的高表达与乳腺癌的临床病理特征，如恶性临床分期、淋巴结转移显著相关。Imam等［23］研究分析发现，在乳腺癌组织中miR-185表达明显下降，其靶基因表达水平则明显上升。有学者鉴定了13 种miRNA在炎性乳腺癌和非炎性乳腺癌组织中的表达情况，一共检测了17 295对miRNA-mRNA，发现有10 283对呈正相关，7 012对呈负相关；其中miR-29a、miR-30b、miR-342-3p和miR-520-5p的靶基因与预测的相同；miR-335、miR-548d-5p和miR-451在炎性乳腺癌中过表达，miR-15a、miR-24、miR-29a、miR-30b、miR-320、miR-342-5p、miR-342-3p、miR-337-5p 和miR-520a-5p在炎性乳腺癌中低表达，为乳腺癌的诊断提供了重要的依据［24］。Sempere等［25］对100多例乳腺癌患者的标本利用原位杂交法测定miRNA的表达情况，结果显示miR-21在乳腺癌组织中表达增加，而let-7表达减少，miR-145和miR-205在正常乳房导管及小叶肌上皮和基底细胞层表达，而在对应的乳腺癌标本中表达下降或完全不表达，其研究还发现miR-145在非典型性增生和乳腺癌中表达明显增加，这提示miR-145可能有希望作为乳腺癌新的早期诊断标志物。Blenkiraon等［26］研究表明miRNA表达谱还可以区分乳腺癌的5个亚型，即luminalA型、luminalB型、HER-2过表达型、Basal-like型(三阴型)和Normal-like型，为乳腺癌的分子分型及个体化治疗提供了理论依据。

2.2 血清miRNA表达与乳腺癌的诊断

miRNA在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNA的损失［27］。由于肿瘤存在高度异质性，组织学取材不能完全代表整体肿瘤组织，而外周血肿瘤核酸可起源于肿瘤内部任何一个亚克隆的群体，因此能更全面反映肿瘤组织丰富的异常分子改变［28］。

至今已报道的多项血清microRNA 与肿瘤的研究工作，为血清miRNA作为分子标志应用于肿瘤的早期诊断和预后判断提供了工作基础。Zhou等［29］在肝癌血浆中筛选到了由7个microRNA组成的早期肝癌诊断分子标志物，并利用这7个血浆microRNA建立了一个诊断模型，对于<2 cm的肝癌诊断准确率接近90%，效果优于传统的AFP。Zhu等［30］对乳腺癌患者血清miR-155的含量进行了小样本的研究，发现血清miR-155 水平在乳腺癌患者和非乳腺癌患者中差异无统计学意义(P>0.05)，但在癌组织孕酮受体阳性的患者中血清含量要高于阴性患者，提示miR-155 可以作为区分激素敏感性和非敏感性的乳腺癌患者的分子标志物，进一步证明血清microRNA 具有成为肿瘤诊断标志物的潜力。Heneghan等［31］挑选了与乳腺癌相关的7个miRNA在乳腺癌患者的肿瘤组织和血浆中进行了比对，发现miR-195 是乳腺癌组织特异的miRNA，在血浆中的水平高于正常水平，能很好地反映患者肿瘤生长的临床病理特征。Zhao等［32］通过比较20例早期乳腺癌患者(10例美国白人和10例美国黑人)以及相应匹配的20例健康人群(10例美国白人和10例美国黑人)的血清miRNA表达发现，血清循环miRNA可以作为潜在的乳腺癌早期诊断的新的无创性生物标志物；研究结果还发现，在美国白人中有31个差异表达的miRNA(17个表达上调，14个表达下调)，在美国黑人中有18个差异表达的miRNA(9个表达上调，9个表达下调)，有趣的是，仅有2种miRNA在美国黑人和白人中均有差异表达，提示血清miRNA的表达具有种族差异性。Schrauder等［33］通过miRNA表达谱检测了早期乳腺癌和健康对照外周血miRNA的表达，结果提示有59个miRNA有差异表达，其中13个显著上调，46个显著下调；通过RBF核函数的支持向量机技术建立模型，其特异度为78.8%，灵敏度为92.5%，准确率为85.6%。Schwarzenbach等［34］发现血清miR-214表达水平可以区分乳腺癌、乳腺良性肿瘤及健康对照人群，ROC曲线下面积为0.878和0.883，结果提示血清游离miR-214是潜在的乳腺癌诊断标志。有学者发现miR-215、miR-299-5p、miR-411和miR-452在乳腺癌组织和血清中存在差异表达，能够帮助区分乳腺癌患者和健康对照，尤其是血清miR-452的异常表达能够提示乳腺癌患者是否发生体内转移［35］。

3 miRNA与乳腺癌的预后判断

特定的miRNAs表达模式与肿瘤的预后相关，因此miRNAs还可能有助于乳腺癌的预后判断。Camps等［36］分析了219例乳腺癌患者预后发现，miR-210与HIF-1a信号通路相关，miR-210的表达水平与乳腺癌的无病生存率和总生存率呈负相关。因此，miR-210可能是乳腺癌预后差的一个独立预测因子。Toyama等［37］检测了58例三阴性乳腺癌患者及103例ER阳性HER2阴性患者miR-210表达情况及其与临床病理的关系，证实miR-210在三阴性乳腺癌的表达水平显著高于ER阳性HER2阴性乳腺癌患者(P<0.001)，也提示了miR-210表达与无病生存期和整体生存显著负相关，miR-210高表达预示预后不良。Valastyan等［19］发现miR-31在转移性乳腺癌细胞中表达明显下调，且miR-31与乳腺癌的无转移生存率呈负相关，miR-31可能是各种亚型乳腺癌转移的分子标志，用来判断乳腺癌的预后。Yan等［22］和Lee等［38］均发现miR-21的高表达与乳腺癌的临床病理特征，如恶性临床分期、淋巴结转移、预后差显著相关。有报道显示，在246例进展期ER阳性、接受他莫昔芬治疗的患者中，miR-30c能够独立预测无疾病进展存活期［39］。Svoboda等［40］利用qRT-PCR方法检测了39例三阴性乳腺癌患者miR-34a、miR-34b、miR-34c的表达水平，结果显示miR-34b表达与无病生存期和整体生存显著负相关，提示miR-34b可作为预测三阴性乳腺癌患者预后新的标志物。Buffa等［41］报道了利用乳腺癌完整的mRNA和miRNA表达谱确定了miRNA相关的进展途径和潜在治疗靶点，发现在雌激素受体阳性患者有4个miRNA、雌激素受体阴性患者有6个miRNA与无远处复发生密切相关，在三阴性乳腺癌中miR-342，miR-27b及miR-150可以作为预后标志；其他几个独立研究也证实，miR-210，miR-128a和miR-27b及其靶基因都具有预后标志的作用。Hanna等［42］利用组织芯片方法检测了473例乳腺癌患者组织miR-21、miR-92a、miR-34a和miR-221的表达水平，结果提示，miR-221是乳腺癌独立的预后因素。Volinia等［43］研究发现9个miRNA在原位癌及浸润癌组织中差异表达，其中let-7d、miR-210和miR-221在原位癌中表达下调，在浸润癌中表达上调；同时提示，miR-210、miR-21、miR-106b、miR-197和 let-7i可以作为预后的生物标志；miR-210与肿瘤的侵袭有关，miR-210的靶基因BRCA1、FANCD、FANCF、PARP1、E-cadherin和Rb1在原位癌中高表达，在转移灶中表达下调。

4 展望

对miRNA的深入研究无疑能增进对乳腺癌发生、发展、转归等机制的认识，促进诊断和治疗的快速发展。当然，作为敏感性较高的分子标志，其统一的检测标准及严格的质控标准仍需时日得以公认。此外，miRNA与临床相关的研究刚刚起步，尚缺乏大样本、多中心、前瞻性的研究数据。随着miRNAs微阵列、实时荧光定量RT-PCR、SNP分析和Northern blot 等各种技术平台的不断发展，miRNAs表达的检测日益精确可靠，将为乳腺癌的诊断和预后判断开辟了新途径，相信不久的将来，随着越来越多的可靠数据的产生，miRNA作为乳腺癌诊断、治疗、疗效预测及预后判断的重要分子标志物可得到极大程度的认可和推广。

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